In Vivo Detektion und Analyse von Rb Protein Sumoylierung in menschlichen Zellen
Summary
Kleine Ubiquitin-bezogene Modifikator (SUMO) Familie Proteine sind an Lysin-Reste von Zielproteine, verschiedene zelluläre Prozesse regulieren konjugiert. Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll für den Nachweis von Retinoblastom (Rb) Protein Sumoylierung endogene und exogene Bedingungen in menschlichen Zellen.
Abstract
Die post-translationalen Modifikationen von Proteinen sind entscheidend für die richtige Regulierung der intrazellulären Signaltransduktion. Unter diesen Änderungen ist kleine Ubiquitin-bezogene Modifikator (SUMO) ein Ubiquitin-wie Protein, das die Lysin-Rückstände verschiedener Zielproteine zu regulieren zelluläre Prozesse wie Gentranskription, DNA-Reparatur, Protein kovalent verbunden ist Interaktion und Abbau, subzelluläre Transport und Signaltransduktion. Die gängigste Methode zur Erkennung von Protein Sumoylierung basiert auf den Ausdruck und die Reinigung von rekombinanten tagged Proteinen in Bakterien, so dass für eine in-vitro- biochemische Reaktion, die ist einfach und eignet sich für den Umgang mit mechanistischen Fragen. Aufgrund der Komplexität des Prozesses der Sumoylierung in Vivoist es jedoch schwieriger zu erkennen und zu analysieren, Protein Sumoylierung in Zellen, vor allem unter endogenen Bedingungen. Eine aktuelle Studie von den Autoren dieses Artikels ergeben, dass endogene Retinoblastom (Rb) Protein, ein Tumorsuppressor, die entscheidend für die negative Regulierung des Zellzyklus Progression, speziell sumoyliert in der frühen G1-Phase. Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll für die Erkennung und Analyse von Rb Sumoylierung endogene und exogene Bedingungen in menschlichen Zellen. Dieses Protokoll eignet sich für die phänotypische und funktionelle Untersuchung der SUMO-Änderung der Rb, sowie viele andere SUMO-gezielte Proteine in menschlichen Zellen.
Introduction
Die genaue Steuerung der Zellzyklus Progression in eukaryontischen Zellen beruht auf einer engen regulatorischen Netzwerk sorgt dafür, dass bestimmte Ereignisse in einer geordneten Art und Weise1,2stattfinden. Einer der wichtigsten Akteure in diesem Netzwerk ist das Retinoblastom (Rb)-Protein, das erste geklonte Tumorsuppressor1,3. Das Rb-Protein wird angenommen, dass ein negativer Regulator der Zellzyklus Progression, vor allem für die G0/G1 S Phasenübergang und Tumor Wachstum4,5. Ausfall der Rb führt entweder direkt auf die am häufigsten verwendeten intraokularen Bösartigkeit bei Kindern, Retinoblastom, oder trägt zur Entwicklung von vielen anderen Arten von Krebs5. Darüber hinaus engagiert sich die Rb in viele zelluläre Signalwege einschließlich der Zelldifferenzierung, Chromatin umgestalten und Mitochondrien-vermittelten Apoptose3,6,7.
Post-translationalen Modifikationen spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulation des RB Funktion8,9. Phosphorylierung ist eine solche Änderung, und es führt in der Regel zu Rb Inaktivierung. In ruhenden G0-Zellen ist Rb aktiv mit einem niedrigen Phosphorylierung. Fortschritt durch G0/G1-Phase Zellen, ist Rb sequenziell hyper phosphoryliert durch eine Reihe von cyclin-abhängige Proteinkinasen (CDKs) und Cyclin, z. B. cyclin E/CDK2 und cyclin D/CDK4/6, die Rb zu inaktivieren und seine Fähigkeit, Zellzyklus unterdrücken zu beseitigen im Zusammenhang mit gen-Ausdruck4,10. RB konnte auch durch kleine Ubiquitin-bezogene Modifikator (SUMO)11,12,13geändert werden.
SUMO ist ein Ubiquitin-wie Protein, das eine Vielzahl von Zielproteinen kovalent verbunden ist. Es ist wichtig für verschiedene zelluläre Prozesse, einschließlich der Regulierung des Zellzyklus, Transkription, Protein zellulären Lokalisation und Abbau, Transport und DNA-Reparatur14,15,16, 17 , 18. der SUMO Konjugation Weg besteht aus dimeres SUMO E1 aktivierende Enzym SAE1/UBA2, der einzigen E2 conjugating Enzym Ubc9 und mehrere E3 Ligases SUMO-spezifische Proteasen. Im Allgemeinen müssen im Entstehen begriffenen SUMO Proteine proteolytisch verarbeitet werden, um die ältere Form zu erzeugen. Reife SUMO ist durch E1-Heterodimer aktiviert und dann auf das Enzym E2 Ubc9 übertragen. Schließlich die C-terminale Glycin Sumo ist kovalent an die Ziel-Lysin eines Substrats konjugiert, und dieser Prozess wird in der Regel durch E3 Ligases erleichtert. Das SUMO Protein kann durch spezifische Proteasen aus dem modifizierten Substrat entfernt werden. Eine frühere Studie von den Autoren dieses Papiers ergab, dass Sumoylierung Rb die Bindung an CDK2 erhöht, führt zu hyper-Phosphorylierung bei der frühen G1-Phase, ein Prozess, der für Zellzyklus Fortschreiten13notwendig ist. Wir zeigten auch, dass der Verlust der Rb Sumoylierung eine verminderte Zellvermehrung verursacht. Darüber hinaus wurde kürzlich gezeigt, dass die Sumoylierung Rb proteasomalen Umsatz, das Rb-Protein schützt somit die Erhöhung des Rb-Protein in Zellen19. Daher spielt Sumoylierung eine wichtige Rolle bei Rb-Funktion in verschiedenen zellulären Prozessen. Weiter zu studieren der funktionalen Konsequenz und physiologische Relevanz von Rb Sumoylierung, ist es wichtig, eine wirksame Methode um die SUMO-Status der Rb in menschlichen Zellen oder Geweben Patienten analysieren zu entwickeln.
Sumoylierung ist eine reversible, hoch dynamischen Prozess. So ist es in der Regel schwer zu erkennen, die SUMO-modifizierte Proteine vollständig endogenen Bedingungen. Dieses Papier stellt eine Methode, um endogene Rb Sumoylierung zu erkennen. Außerdem zeigt es, wie exogene Rb Sumoylierung Wildtyp Rb und seine SUMO-defizienten Mutation11erkannt. Jacobs Et Al. beschrieben vor allem eine Methode, um die SUMO-Änderung eines bestimmten Substrats speziell von Ubc9 unter der Regie von Fusion Sumoylierung (UFD)20erhöhen. Basierend auf dieser Methode, beschreibt dieses Protokoll die erzwungene Sumoylierung Rb und seiner funktionellen Konsequenzen zu analysieren. Da die Hunderte von SUMO Substrate bisher beschrieben worden sind und weitere vermeintliche SUMO Substrate aus vielen Proteomic basierende Assays identifiziert wurden, kann dieses Protokoll angewendet werden, um die SUMO-Modifikation dieser Proteine in menschlichen Zellen zu analysieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll zum erkennen und analysieren der endogenen Sumoylierung Rb in menschlichen Zellen. Da diese Methode speziell auf das endogene Rb-Protein ohne jede Abwechslung der globalen SUMO-bezogenen Signal ausgerichtet ist, ist es ein wichtiges Instrument für die Untersuchung von Rb-SUMO Modifikation unter völlig natürlichen physiologischen Umständen.
Um dieses Ziel zu erreichen, ist es wichtig, im Hinterkopf behalten, dass: 1) Obwohl SUMO vier Isoformen (SUM…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus der Wissenschaft und Technologie Kommission von Shanghai (Grant Nr. 14411961800) und National Natural Science Foundation of China (Grant Nr. 81300805).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Triton X-100 | AMRESCO | 694 | |
| RNase A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E3876 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | AMRESCO | M107 | |
| Nonidet P-40 Substitute (NP-40) | AMRESCO | M158 | |
| protease inhibitor | Roche | 5892970001 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Rb antibody | Cell Signaling Technology | #9309 | |
| Protein A/G-Sepharose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| Lipofectamine-2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads | Qiagen | 30230 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| 4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel | BIO-RAD | 4561096 | |
| Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Tween-20 | AMRESCO | M147 | |
| Tubulin antibody | Abmart | M30109 | |
| SUMO1 antibody | Thermo Fisher Scientific | 33-2044 | |
| GFP antibody | Abmart | M20004 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| enhanced chemiluminescence (ECL) Kit | Thermo Fisher Scientific | 32106 |
References
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