JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Developmental Biology

C. elegans Excretory kanalen som en Model for intracellulære Lumen morfogenese og In Vivo polariseret membran Biogenese i en enkelt celle: mærkning af normal god landbrugspraksis-fusioner, RNAi interaktion skærm og billedbehandling

Published: October 03, 2017
doi:
10.3791/56101
, , , , ,
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Developmental Biology and Genetics Core, Massachusetts General Hospital for Children,Harvard Medical School, 2College of Life Sciences,Jilin University, 3Faculty of Health Sciences,University of Macau

Summary

C. elegans ekskretionsorganerne kanalen er en unik én celle model for den visuelle i vivo analyse af de novo polariseret membran Biogenese. Denne protokol beskriver en kombination af standard genetiske/RNAi og imaging tilgange, kan tilpasses til identifikation og karakterisering af molekyler lede encellede tubulogenesis og apikale membran og lumen Biogenese.

Abstract

De fire C. elegans ekskretionsorganerne kanaler er smalle rør udvidet gennem længden af dyret fra en enkelt celle, med næsten lige så langt udvidede intracellulære endotubes, der opbygger og stabilisere lumen med en membran og submembraneous cytoskelettet apikale karakter. Cellen ekskretionsorganerne udvider sin længde ca 2.000 gange til at generere disse kanaler, hvilket gør denne model enestående i vivo -vurdering af de novo polariseret membran Biogenese, intracellulære lumen morfogenese og encellede tubulogenesis. Protokollen præsenteres her viser, hvordan man kombinerer standard mærkning, gevinst og tab-af-funktion genetiske eller RNA-interferens (RNAi)-, og mikroskopisk tilgange til at bruge denne model til visuelt dissekere og funktionelt analyserer disse processer på molekylært niveau. Som et eksempel på en mærkning tilgang protokollen skitserer generation af transgene dyr med fluorescerende fusion proteiner til live analyse af tubulogenesis. Som et eksempel på en genetisk tilgang fremhæver det hovedpunkterne i en visuel RNAi-baserede interaktion skærm designet til at ændre en gevinst af funktion cystisk kanalen fænotype. De specifikke metoder beskrevet sådan: etiket og visualisere kanalerne ved at udtrykke fluorescerende proteiner; konstruere en målrettet RNAi bibliotek og strategize RNAi screening for Molekylær analyse af canal morfogenese; visuelt vurdere ændringer af canal fænotyper; score dem ved at dissekere Fluorescens mikroskopi; karakterisere subcellulært canal komponenter på højere opløsning af konfokalmikroskopi; og kvantificere visuelle parametre. Fremgangsmåde er nyttig for den efterforsker, der er interesseret i at drage fordel af C. elegans ekskretionsorganerne kanalen for at identificere og karakterisere gener involveret i de Fylogenetisk bevaret intracellulære lumen og encellede Tube morfogenese.

Introduction

Alle indre organer er sammensat af rør, afgørende for deres mange forskellige funktioner, såsom transport og udveksling af gasser, væsker og næringsstoffer og udskillelsen af metaboliske affald. Deres polariseret karakter, med særskilte apikale og lumenal membraner, er tilpasset til disse bestemte funktioner, og mangler i Biogenese aspekt(er) endo- og plasma membran er en hyppig årsag til sygdom hos mennesker1,2. Fleste af rør Vaskulaturen og indre organer er flercellede og danne en lumen intercellularly; dog kan, encellede rør, der udgør lumen intracellulært, for eksempel repræsenterer så meget som 30 – 50% af menneskelige kapillær senge2. Polariseret membraner i multi- og encellede rør er ens i sammensætning, selv om deres microdomains kan variere baseret på tube’s specifikke funktion (fx, ekskretionsorganerne canal canaliculi versus intestinal microvilli i Caenorhabditis elegans; Se ledsager papir på C. elegans intestinale tubulogenesis)3. Principperne for polariseret membran Biogenese og tubulogenesis er bevaret blandt metazoans, og en lignende molekylære maskineri dirigerer dem1,2,4.

C. elegans ekskretionsorganerne system består af fem celler: ekskretionsorganerne cellen (EF), kanal celle (DC), pore celle (PC) og to kirtel celler. Ablation af EF, DC eller PC forårsager væskeophobning i kroppen hulrum og dyr dø på en tidlig larve fase5. Intriguingly, disse tre encellede rør oprette deres lumen på tre forskellige måder: ved celle udhuling (EF); celle indpakning kombineret med autocellular junction dannelse (PC); og af celle indpakning kombineret med autofusion (DC); forskellige mekanismer af lumen morfogenese, der alle Fylogenetisk bevarede6,7. EF, beliggende på den venstre laterale side af den bageste svælg pære, sender ud to laterale udvidelser fra som de fire kanaler forgrene sig for at udvide Anteriort og posteriort (i både højre og venstre side) til spidsen af den orm næse og hale , henholdsvis (figur 1)5,6,8. EF strækker sig fra ca 1 µm til 2 x 1.000 µm, hvilket gør det til den største celle i dyret. På en subcellulært niveau er den ekskretionsorganerne kanalen en enkel tube, genereret fra en basal membran rettet mod pseudocoelom, og tunneled af en lumenal membran (endotube). Canal lumenal membranen forbinder til kanalen lumenal membran på sin kun intercellulære junction; kanalerne er ellers junctionless langs deres længder (figur 1). Ekskretionsorganerne canal lumenal membranen og dens submembraneous cytoskelet er apikale, defineret ved deres molekylære sammensætning, der minder om sammensætningen af den apikale membran og submembraneous cytoskelet flercellede rør, såsom tarmen, og af andre (fxflade) epitheler. Cytoplasmatisk organeller, inklusive endosomal vesikulær og andre (fxGolgi) endomembranes er fordelt langs længden af kanalen. Derudover er flere kanalikulær vesikler – enten tilsluttet lumenal membranen, og/eller indbyrdes forbundne eller isoleret – gevind gennem kanalen cytoplasma7,8,9,10 . Denne dynamiske plasma-membran/kanalikulær forbindelse yderligere udvider kanalens membran system og bidrager til begge lumen morfogenese og osmoregulering10. Ekskretionsorganerne kanalen består således næsten udelukkende af endo- og plasma membraner, give en fremragende model for analyse af polariseret membran Biogenese og regulering af endo-plasma membran interface. En dramatisk udvidelse af den apikale membran under kanalen morfogenese – i denne single-celle systemet sammenfaldende med lumen udvidelse – giver også mulighed for at analysere de arkitektoniske problemer som følge af behovet for at stabilisere og centrere en intracellulær lumenal membran . Denne protokol fokuserer på analyse af kanalen røret og lumen’s strukturelle morfogenese og intracellulære membran dynamics kræves for denne proces og ikke på de signaler, der direkte celle bevægelser, der genererer EFS holdning i de ekskretionsorganerne system og konstruere dets indviklede forbindelser til andre cellulære elementer (gennemgik i6).

En yderligere fordel af C. elegans encellede canal system til analyse af polariseret membran og intracellulære lumen Biogenese er dens evne til at adskille, gennem udviklingsmæssige tid, generation af forskellige komponenter af dets membraner og knudepunkter. EF er født på tidspunktet for ventrale lukning og afregner ventro sideværts i svælget under midten af embryogenese5,6,8, hvor tid laterale canal udvidelse og forgrening forekomme. Dette er efterfulgt af anterior-posterior canal udvidelse under sent embryogenese, en proces, som fortsætter ind i stadiet L1-larver (figur 1). I en nyklækkede larve, den bageste kanalen tip når frem til cirka midten af ormen, fuldt udvide til halen slutningen af L1 scenen, hvorefter kanalen elongates sammen med orm8. Aktive canal vækst på en hastighed på over for dyrets vækst dermed ender på den første larve stadie, men yderligere vækst sker sideløbende med en vækst på hele dyret under de ekstra larve faser (L2-4). Denne indstilling giver mulighed for at analysere forskellige trin i de novo polariseret membran Biogenese uafhængigt af polariseret celledeling eller migration. Desuden, det tillader adskillelse af denne proces fra samling af knudepunkter (som forekommer i embryoet før lumen indledning); deres nøjagtige krav i membranen polarisering er stadig et åbent spørgsmål i feltet polaritet. Endelig adskiller det entydigt apikale fra basale membran ekspansion, sidstnævnte processen forud for tidligere i ekskretionsorganerne kanaler10. C. elegans ekskretionsorganerne kanalen model er derfor en særlig informativ supplement til den intestinale model, som deler en række af disse fordele til analyse af polariseret membran Biogenese men udfører det i flercellede omgivelser (jf. den ledsagende papir på tarm tubulogenesis3).

Selv om wild-type kanaler ultratynde tubuli i denne lille orm, kan deres lumen være visualized direkte af Nomarski optik i dette gennemsigtige dyr. Mutant cystisk kanalen morfologier kan faktisk karakteriseres i umærkede dyr ved hjælp af lav forstørrelse dissekere mikroskopi, som har været brugt med stor effekt i fremad genetiske skærme til at identificere gener involveret i tubulogenesis11. Forbedret visualisering af morfologi af kanaler og skelnen mellem deres polariseret membraner, cytoskeletal komponenter, forskellige intracellulære organeller og andre subcellulært strukturer, men kræver mærkning og højere magt fluorescerende dissekere og konfokal mikroskopi. Selv om kanaler fine struktur udgør en række vanskeligheder for mærkning og mikroskopi, membraner og subcellulært komponenter kan skelnes via de specifikke molekyler unikke for hvert rum, og dyr kan være sikkert monteret til mikroskopi, hvis visse forholdsregler er truffet for at undgå at indføre artefakter (Se protokollen og diskussion). Mærkning kan gøres af Immunhistokemi i faste enheder, eller ved at generere transgene orme at udtrykke fluorescerende fusion proteiner under deres egen kontrol eller ekskretionsorganerne canal-specifikke initiativtagere til i vivo billeddannelse. Denne protokol beskriver den sidstnævnte mærkning teknik (se den ledsagende papir på tarm tubulogenesis for antistof farvning3).

Evnen til at kombinere i vivo tab eller gevinst-af-funktion undersøgelser med i vivo billeddannelse analyse på det enkelt celle niveau i hele udvikling gør C. elegans ekskretionsorganerne kanalen en særlig stærk model for den molekylære og cellulære analyse af encellede tubulogenesis. Frem eller omvendt genetiske skærme kan udføres starter med en wild-type eller mærket transgene dyr til at identificere canal morfogenese fænotyper (for eksempel, cyster) og deres underliggende gendefekter. Alternativt, sådanne skærme kan starte med en mutant fænotype (fx, en cystisk kanalen) og identificere overspændingsbeskyttere eller smagsforstærkere af denne fænotype for at identificere gener, der funktionelt interagerer med genet forårsager mutant fænotype. Den genetiske defekt forårsager mutant fænotype kan fremkalde et tab (f.eks., via gen sletning) eller en gevinst (f.eks. via en aktiverende mutation eller via indførelse af overskydende gen kopier) af de undersøgte funktion. Videresende mutagenese eller systematisk RNAi skærme er uden forudfattede meninger om genfunktioner og til upartisk identificering af gener involveret i funktionen af interesse. Betragtning af tilgængeligheden af genome-wide RNAi fodring biblioteker, kan næsten hvert gen være let slået ned af RNAi i C. elegans, således at enhver enkelt gen af interesse eller enhver gruppe af gener (fxi målrettede skærme) kan også være hurtigt aftestede for deres virkning i en omvendt genetik tilgang. For at påvise en eventuel kombination af tilgange, vi her beskrive en målrettet RNAi interaktion skærm, begyndende med en gevinst af funktion cystisk ekskretionsorganerne canal mutant, mærket med cytoplasmatisk canal grøn fluorescerende proteiner (NGL). Mutant fænotype blev genereret af overekspression af erm-1, en yderst velbevarede C. elegans ortholog af familien membran-actin linker Ezrin-Radixin-Moesin (ERM), som har været impliceret i lumen morfogenese og membran organisationen i mange arter12. C. elegans ERM-1 lokaliserer til lumenal membraner af indre organer, såsom ekskretionsorganerne canal og tarmen, og der kræves til lumen dannelse i begge13. ERM-1 overekspression rekrutter overskydende aktin og vesikler til canal lumenal membran, stigende flux i lumen og generere en kort cystisk kanalen og en krympede lumenal membran med fortykket actin underuld9. Protokollen beskriver hvordan man kan generere transgene stammer med ekskretionsorganerne udtrykt canal mærket fusion proteiner (eller andre proteiner); Hvordan til at udføre målrettede RNAi skærme starter med disse stammer til at identificere modifikatorer for en canal fænotype; og hvordan man visuelt analysere resultaterne af sådanne skærme af fluorescens dissekere og konfokal mikroskopi, herunder enkle måder at kvantificere informative tubulogenesis fænotyper. Alternativ mærkning teknikker og detaljer af RNAi, justeret til de ofte dødbringende tubulogenesis gener, kan findes i det ledsagende dokument på tarm tubulogenesis3. Alle metoder kan anvendes i forskellige kombinationer for undersøgelse af andre spørgsmål på kanalen tubulogenesis.

Protocol

1. mærkning af C. elegans Excretory kanalen af fluorescerende Fusion proteiner 14 Note: Se den ledsagende papir på tarm tubulogenesis 3 for mærkning af i situ antistof farvning procedurer kan tilpasses til ekskretionsorganerne kanalen. Se tabel 1 eksempler på molekyler vist sig nyttige til at visualisere C. elegans ekskretionsorganerne canal endo- og plasma membraner, tabel 2 eks…

Representative Results

Denne protokol beskriver hvordan man bruger C. elegans ekskretionsorganerne kanaler til visuelt og molekylært analysere encellede tubulogenesis og intracellulære lumen morfogenese i en enkelt celle. Under deres udvidelse fra tidspunktet for midten embryogenese til voksenalderen, de fire ekskretionsorganerne kanaler fortsætter med at udvide deres basolateral og apikale/lumenal membraner sammen med deres kanalikulær og endosomal endomembrane system, der giver en enestående mod…

Discussion

C. elegans genetiske alsidighed, gennemsigtighed, enkel krop plan og invariante celle lineage gør det en fremragende model for analyse af morfogenese. Denne protokol beskriver hvordan man kombinerer standard genetiske manipulationer og billedbehandling undersøgelser for at drage fordel af 2 micron tynd C. elegans ekskretionsorganerne kanaler for at studere polariseret membran og intracellulære lumen Biogenese i en enkelt celle tube.

Mærkning
C. ele…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker M. Buechner (University of Kansas, Kansas, USA), K. Nehrke (University of Rochester Medical Center, Rochester, New York, USA) og byens Caenorhabditis genetik, finansieret af National Institutes of Health, kontoret for forskningsinfrastruktur Programmer (P40 OD010440). Dette arbejde blev støttet af tilskud NIH GM078653, MGH er 224570 og SAA 223809 at V.G.

Materials

Cloning
Plasmid pPD95.75 Addgene Cat. No. 37464
PCR Kit Qiagen Cat. No. 27106
Ligation kit New England Biolabs Cat. No. E2611L
DNA marker Thermo Scientific Cat. No. SM1331
Agarose DNA grade Fisher Scientific Cat. No. BP164-100
Competent cells New England Biolabs Cat. No. C2987H
Tris Fisher Scientific Cat. No. BP154-1
EDTA Sigma Cat. No. ED-1KG
Acetic acid Fisher Scientific Cat. No. A38S-500
Ethidium bromide Fisher Scientific Cat. No. BP1302-10
Equipments
PCR machine  MJ Research Cat. No. PTG-200 
Centrifuge Eppendorf  Cat. No. 5415C
Water Bath Precision Scientific  Cat. No. 666A3 
Gel running instrument Fisher Scientific Cat. No. 09-528-165
Gel running power supply Fisher Scientific Cat. No. 45-000-465
Molecular Imager Gel Doc XR System Bio-Rad Cat. No. 1708195EDU
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific Cat. No. ND1000
C. elegans related1 1see reference27 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates2 2see reference24 for protocols.
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Yeast Extract BD Biosciences Cat. no. 212750
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
Ampicillin Sigma Cat. no. A0116
Tetracycline Fisher Scientific Cat. no. BP912
M9 Medium2 2see reference24 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
Na2HPO4 Sigma Cat. no. S7907
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
NGM plates 2 2see reference24 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Peptone  BD Biosciences Cat. no. 211677
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
CaCl2 Sigma Cat. no. C3881
Cholesterol  Sigma Cat. no. C8667
K2HPO4  Sigma Cat. no. P3786
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
RNAi plates3 3see reference60 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Peptone  BD Biosciences Cat. no. 211677
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
CaCl2 Sigma Cat. no. C3881
Cholesterol  Sigma Cat. no. C8667
K2HPO4  Sigma Cat. no. P3786
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
IPTG  US Biological Cat. no. I8500
Carbenicillin Fisher Scientific Cat. no. BP2648
NaOH Fisher Scientific Cat. no. SS266-1
Sodium hypochlorite Fisher Scientific Cat. no. 50371500
Bacteria
OP50 bacteria CGC
HT115 bacteria CGC
Genome-wide RNAi libraries
Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref29,49) Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref50) Source BioScience
Imaging related
Lidocaine MP Biomedicals,LLG Cat. no. 193917
Materials
Vacuum Grease Silicone Beckman Cat. no. 335148
Microscope slides  Fisher Scientific Cat. no. 4448
Microscope coverslips (22×22-1） Fisher Scientific Cat. no. 12-542-B
Tissue culture plate, 6 well  Corning Inc. Cat. no. 08-772-33
Equipment
SMZ-U dissecting microscope (Nikon)
SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions).
TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem)
C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lubarsky, B., Krasnow, M. A. Tube morphogenesis: making and shaping biological tubes. Cell. 112 (1), (2003).
  2. Sundaram, M. V., Cohen, J. D. Time to make the doughnuts: Building and shaping seamless tubes. Semin. Cell Dev. Biol. S1084-9521, 30130-30136 (2016).
  3. Zhang, N. The C. elegans intestine as a model for intercellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis at the single-cell level. JoVE. , (2017).
  4. Andrew, D. J., Ewald, A. J. Morphogenesis of epithelial tubes: Insights into tube formation, elongation, and elongation. Dev. Biol. 341 (1), 34-55 (2010).
  5. Nelson, F. K., Albert, P. S., Riddle, D. L. Fine structure of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system. J. Ultrastruct. Res. 82 (2), 156-171 (1983).
  6. Sundaram, M. V., Buechner, M. The Caenorhabditis elegans Excretory System: A Model for Tubulogenesis, Cell Fate Specification, and Plasticity. Genetics. 203 (1), 35 (2016).
  7. Altun, Z. F., Hall, D. H. Excretory system. WormAtlas. , (2009).
  8. Buechner, M. Tubes and the single C. elegans excretory cell. Trends Cell Biol. 12 (10), 479-484 (2002).
  9. Khan, L. A. Intracellular lumen extension requires ERM-1-dependent apical membrane expansion and AQP-8-mediated flux. Nat. Cell Biol. 15 (2), 143-156 (2013).
  10. Kolotuev, I., Hyenne, V., Schwab, Y., Rodriguez, D., Labouesse, M. A pathway for unicellular tube extension depending on the lymphatic vessel determinant Prox1 and on osmoregulation. Nat. Cell Biol. 15 (2), 157-168 (2013).
  11. Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Dev. Biol. 214 (1), 227-241 (1999).
  12. Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (4), 276-287 (2010).
  13. Gobel, V., Barrett, P. L., Hall, D. H., Fleming, J. T. Lumen morphogenesis in C. elegans requires the membrane-cytoskeleton linker erm-1. Dev. Cell. 6 (6), 865-873 (2004).
  14. Sambrook, J., Sambrook, J., DW, R. u. s. s. e. l. l. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2006).
  15. Fire, A., Harrison, S. W., Dixon, D. A modular set of lacZ fusion vectors for studying gene expression in Caenorhabditis elegans. Gene. 93 (2), 189-198 (1990).
  16. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  17. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  18. Pawley, J. B. . Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).
  19. Hibbs, A. R. . Confocal Microscopy for Biologists. , (2004).
  20. Bankhead, P. . Analyzing fluorescence microscopy images with ImageJ. , (2014).
  21. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157 (3), 1217-1226 (2001).
  22. Frøkjaer-Jensen, C. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).
  23. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).
  24. Barrangou, R. Cas9 Targeting and the CRISPR Revolution. Science. 344 (6185), 707-708 (2014).
  25. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
  26. Esposito, D., Garvey, L. A., Chakiath, C. S. Gateway cloning for protein expression. Methods Mol. Biol. 498, 31-54 (2009).
  27. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  28. Hobert, O. PCR fusion-based approach to create reporter gene constructs for expression analysis in transgenic C. elegans. Biotechniques. 32 (4), 728-730 (2002).
  29. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat. Rev. Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
  30. Berry, K. L., Bulow, H. E., Hall, D. H., Hobert, O. A. C. elegans CLIC-like protein required for intracellular tube formation and maintenance. Science. 302 (5653), 2134-2137 (2003).
  31. Mattingly, B. C., Buechner, M. The FGD homologue EXC-5 regulates apical trafficking in C. elegans tubules. Dev. Biol. 359 (1), 59-72 (2011).
  32. Shaye, D. D., Greenwald, I. The disease-associated formin INF2/EXC-6 organizes lumen and cell outgrowth during tubulogenesis by regulating F-actin and microtubule cytoskeletons. Dev. Cell. 32 (6), 743-755 (2015).
  33. Lant, B. CCM-3/STRIPAK promotes seamless tube extension through endocytic recycling. Nat. Commun. 6 (6), 6449 (2015).
  34. Paupard, M. C., Miller, A., Grant, B., Hirsh, D., Hall, D. H. Immuno-EM localization of GFP-tagged yolk proteins in C. elegans using microwave fixation. J. Histochem. Cytochem. 49 (8), 949-956 (2001).
  35. Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 885-891 (2005).
  36. Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
  37. Sherman, T. The abts and sulp families of anion transporters from Caenorhabditis elegans. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 289 (2), C341-C351 (2005).
  38. . Transgeneome website Available from: https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html (2017)
  39. . National BioResource Project (NBRP)::C. elegans Available from: https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/ (2017)
  40. Heppert, J. K. Comparative assessment of fluorescent proteins for in vivo imaging in an animal model system. Mol. Biol. Cell. 27 (22), 3385-3394 (2016).
  41. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  42. . BLAST Available from: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2017)
  43. Kamath, R. S., Martinezcampos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002 (2001).
  44. Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  45. Rual, J. F. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome research. 14 (10B), 2162-2168 (2004).

Tags

C. ElegansExcretory CanalIntracellular LumenPolarized Membrane BiogenesisTubulogenesisPolarityGFP FusionRNAiLive ImagingMembrane MarkersOrganelle MarkersPromotersERM-1Cystic Canal PhenotypeModifier Screen
check_url/56101?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhang, N., Membreno, E., Raj, S., Zhang, H., Khan, L. A., Gobel, V. The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging. J. Vis. Exp. (128), e56101, doi:10.3791/56101 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image