JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

Het kanaal Excretory C. elegans als een Model voor de intracellulaire Lumen genuitdrukking en In Vivo gepolariseerde biogenese van organellen in één cel: labelen door GFP-fusies, RNAi interactie scherm en beeldvorming

Published: October 03, 2017
doi:
10.3791/56101
, , , , ,
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Developmental Biology and Genetics Core, Massachusetts General Hospital for Children,Harvard Medical School, 2College of Life Sciences,Jilin University, 3Faculty of Health Sciences,University of Macau

Summary

Het uitscheidingsmechanisme kanaal van C. elegans is een uniek eencellige model voor de visuele in vivo analyse van biogenese van DOVO gepolariseerd. Dit protocol beschrijft een combinatie van standaard genetische/RNAi en imaging benaderingen, aanpasbaar voor de identificatie en karakterisering van moleculen eencellige tubulogenesis en apicale membraan en lumen biogenese regisseren.

Abstract

De vier C. elegans uitscheidingsmechanisme grachten zijn smalle buizen uitgebreid door de lengte van het dier uit een enkele cel, met bijna even veel uitgebreide intracellulaire endotubes die bouwen en stabiliseren de lumen met een membraan en submembraneous cytoskelet apicale karakter. De uitscheidingsmechanisme cel breidt haar lengte ongeveer 2.000 keer voor het genereren van deze kanalen, waardoor dit model unieke Voordebeoordeling in vivo van DOVO gepolariseerde biogenese, intracellulaire lumen genuitdrukking en eencellige tubulogenesis. Het hier gepresenteerde protocol laat zien hoe te combineren standaard labelen, winst – en verlies-van-functie genetische of RNA-interferentie (RNAi)-, en microscopische benaderingen gebruiken dit model om te ontleden visueel en functioneel het analyseren van deze processen op een moleculair niveau. Als een voorbeeld van een aanpak van labeling schetst het protocol de generatie transgene dieren met fluorescerende fusion eiwitten voor live analyse van tubulogenesis. Als een voorbeeld van een genetische benadering wijst zij op belangrijke punten van een visuele RNAi gebaseerde interactie scherm ontworpen om te wijzigen van een winst-of-function cystic kanaal fenotype. Zijn er de specifieke methoden beschreven hoe: label en visualiseren van de grachten met het uitspreken van fluorescente proteïnen; bouwen van een gerichte RNAi bibliotheek en strategize RNAi screening voor de moleculaire analyse van kanaal morfogenese; visueel beoordelen van wijzigingen van kanaal fenotypen; Score van hen door de ontrafeling van de fluorescentie microscopie; karakteriseren subcellular kanaal onderdelen met een hogere resolutie van de confocal microscopie; en kwantificeren van de visuele parameters. De aanpak is handig voor de onderzoeker die geïnteresseerd is in het voordeel halen van het uitscheidingsmechanisme C. elegans -kanaal voor de identificatie en karakterisering van genen die betrokken zijn bij de fylogenetisch geconserveerde processen van intracellulaire lumen en eencellige buis morfogenese.

Introduction

Alle interne organen zijn samengesteld uit buizen, cruciaal zijn voor hun vele verschillende functies, zoals het vervoer, de uitwisseling van gassen, vloeistoffen en voedingsstoffen en de uitscheiding van metabolische afval. Hun gepolariseerde karakter, met duidelijke apicale en lumenal membranen, is aangepast aan deze specifieke functies, en gebreken in de biogenese van hun systemen voor endo- en plasmamembraan zijn een frequente oorzaak van ziekten bij de mens1,2. De meerderheid van de buizen van de therapieën en inwendige organen zijn meercellig en vormen een lumen intercellularly; echter, eencellige buizen, die het lumen intracellulair vormen, kunnen, bijvoorbeeld, zo veel als 30-50% van de menselijke capillair bedden2vertegenwoordigen. De gepolariseerde membranen van multi- en eencellige buizen zijn qua samenstelling, hoewel hun microdomains op basis van de specifieke functie van de buis (bijv., uitscheidingsmechanisme kanaal canaliculi versus intestinale microvilli in Caenorhabditis verschillen kunnen elegans; Zie bijbehorende papier op C. elegans intestinale tubulogenesis)3. Bewaring van de beginselen van biogenese van gepolariseerde en tubulogenesis worden toegepast onder metazoans, en een soortgelijk moleculaire machines dirigeert ze1,2,4.

Het uitscheidingsmechanisme systeem van C. elegans bestaat uit vijf cellen: de uitscheidingsmechanisme-cel (EG), koker cel (DC), porie cel (PC) en twee cellen van de klier. Ablatie van de EG, DC of PC zorgt ervoor dat vocht ophoping in de lichaamsholte en het sterven van de dieren op een vroege larvale stadium5. Intrigerend, deze drie eencellige buizen maken hun lumen op drie verschillende manieren: door cel uitholling (EG); cel inwikkeling in combinatie met autocellular junction vorming (PC); en door cel inwikkeling in combinatie met autofusion (DC); verschillende mechanismen van lumen morfogenese die alle fylogenetisch geconserveerde6,7. De EG, gelegen aan de linker laterale kant van de posterieure faryngaal lamp, stuurt twee zijdelingse extensies uit die de vier grachten uit te breiden anteriorly tak en posteriorly (aan de rechter en linker kant) naar het uiteinde van de van de worm neus en staart , respectievelijk (Figuur 1)5,6,8. De EG strekt zich uit van ongeveer 1 µm tot 2 x 1.000 µm, waardoor het de grootste cel van het dier. Op een subcellular niveau is het uitscheidingsmechanisme kanaal een eenvoudige buis, gegenereerd op basis van een basale membraan gericht op de pseudocoelom en tunnel door een lumenal membraan (endotube). Het kanaal lumenal membraan verbindt aan de buis lumenal membraan zijn alleen intercellulaire afslag; de grachten zijn anders junctionless langs hun lengte (Figuur 1). Het uitscheidingsmechanisme kanaal lumenal membraan en haar submembraneous cytoskelet zijn apicaal, gedefinieerd door hun moleculaire compositie die lijkt op de samenstelling van de apicale membraan en submembraneous cytoskelet van meercellige buizen, zoals de darm, en van andere epitheel (bijvoorbeeldplat). Cytoplasmatische organellen, met inbegrip van endosomal vesiculaire en andere (bijvoorbeeldGolgi) endomembranes zich langs de lengte van het kanaal bevinden. Daarnaast zijn meerdere canalicular blaasjes – verbonden met het lumenal membraan, en/of onderling verbonden of geïsoleerd – threaded via het kanaal cytoplasma7,8,9,10 . Deze dynamische plasma-membraan/canalicular verbinding verder van het kanaal membraan systeem breidt en draagt bij aan beide lumen genuitdrukking en osmoregulatie10. Het uitscheidingsmechanisme kanaal bestaat dus bijna volledig van endo- en plasma membranen, bieden een uitstekend model voor de analyse van gepolariseerde biogenese en de regulering van de endo-aan plasmamembraan interface. De dramatische uitbreiding van de apicale membraan tijdens kanaal morfogenese – in dit samenvallen met lumen extensie – eencellige-systeem maakt het ook mogelijk om te analyseren de architecturale problemen die ontstaan door de noodzaak te stabiliseren en centreren van een intracellulaire lumenal membraan . Dit protocol is gericht op de analyse van de kanaal buis van en lumen van structurele genuitdrukking en de dynamiek van de intracellulaire membraan vereist voor dit proces in plaats van op de signalen die direct van de bewegingen van de cel die het genereren van de EG positie in de uitscheidingsmechanisme systeem en de ingewikkelde verbindingen met andere cellulaire elementen (herzien in6) op te bouwen.

Een ander voordeel van de C. elegans eencellige kanaal systeem voor de analyse van gepolariseerde membraan en intracellulaire lumen biogenese is haar vermogen om te scheiden, door de ontwikkelings tijd, de generatie van verschillende onderdelen van de membranen en kruispunten. De EG is geboren op het moment van sluiting van de ventrale en regelt ventro-lateraal van de keelholte tijdens mid embryogenese5,6,8, waarin verlenging van de laterale kanaal en vertakking voordoet. Dit wordt gevolgd door anterior-posterior kanaal extensie tijdens late embryogenese, een proces dat in de L1-larvale stadium (Figuur 1 blijft). In een onlangs uitgekomen larve, de tip van achterste kanaal bereikt ongeveer het midden van de worm, samen met de worm8volledig uit te breiden tot de staart aan het einde van de etappe van L1, waarna het kanaal kieuwopeningenvorm. Actieve kanaal groei op een maximumsnelheid van meer dan die van de groei van het dier dus eindigt bij het eerste larvale stadium, echter, verdere groei gebeurt parallel met de groei van het hele dier tijdens de extra larvale stadia (L2-4). Deze instelling biedt de mogelijkheid om te analyseren verschillende stappen van DOVO gepolariseerde biogenese onafhankelijk van gepolariseerde celdeling of migratie. Bovendien, het maakt het mogelijk de scheiding van dit proces van de vergadering van kruispunten (die voorkomen in het embryo voordat lumen Inleiding); hun exacte behoefte in membraan polarisatie is nog steeds een open vraag op het gebied van de polariteit. Ten slotte, het unieke scheidt apicale van basale membraan expansie, het laatste proces voorafgaat aan de voormalige in de uitscheidingsmechanisme grachten10. De C. elegans uitscheidingsmechanisme kanaal model is dan ook een bijzonder informatief aanvulling op de intestinale model dat deelt een aantal van deze voordelen voor de analyse van gepolariseerde biogenese maar wordt het uitgevoerd in een meercellig instelling (Zie het begeleidende document op intestinale tubulogenesis3).

Hoewel wild-type kanalen uiterst dunne buisjes in deze kleine worm zijn, kunnen hun lumen visualized direct door Nomarski optica in dit transparante dier. Mutant cystic kanaal morphologies kunnen in feite worden gekarakteriseerd in labelloze dieren met behulp van lage vergroting ontrafeling van microscopie, die te groot effect in voorwaartse genetische schermen is gebruikt om genen die betrokken zijn bij tubulogenesis11te identificeren. Verbeterde visualisatie van de morfologie van grachten en onderscheid van hun gepolariseerde membranen, cytoskeletal onderdelen, verschillende intracellulaire organellen en andere subcellular structuren, echter, vereist labeling en hoger macht TL ontleden en confocal microscopie. Hoewel de grachten fijne structuur een aantal moeilijkheden voor het benoemen en microscopie vormt, membranen en subcellular onderdelen via de specifieke moleculen die uniek zijn voor elk compartiment kunnen worden onderscheiden, en dieren kunnen worden veilig gemonteerd voor microscopie als bepaalde voorzorgsmaatregelen worden genomen om te voorkomen dat de invoering van artefacten (Zie Protocol en discussie). Etikettering kan worden gedaan door immunohistochemistry in vaste specimens, of door het genereren van transgene wormen uiting van fluorescerende fusion eiwitten onder de controle van hun eigen of uitscheidingsmechanisme kanaal-specifieke initiatiefnemers voor in vivo imaging. Dit protocol beschrijft de laatste labeling techniek (Zie het begeleidende document op intestinale tubulogenesis voor antilichaam3kleuring).

De mogelijkheid om te combineren in vivo – of winst-van-verliesfunctie studies met in vivo imaging analyse op de eencellige niveau in de gehele ontwikkeling maakt het uitscheidingsmechanisme kanaal van C. elegans een bijzonder sterke model voor de moleculaire en cellulaire analyse van eencellige tubulogenesis. Forward of reverse genetische schermen kunnen worden uitgevoerd vanaf een wild-type of gelabelde transgene dieren te identificeren kanaal morfogenese fenotypen (bijvoorbeeld cysten) en hun onderliggende genetische defecten. Als alternatief, dergelijke schermen kunnen beginnen met een mutant fenotype (bijvoorbeeld, een cystic kanaal) en identificeren van suppressors of versterkers van dit fenotype ter identificatie van genen die functioneel interactie met de gen veroorzaakt het mutant fenotype. Het genetische gebrek dat veroorzaakt het mutant fenotype een verlies (bijvoorbeeld, via de schrapping van de gene) of een winst kan veroorzaken (bijvoorbeeld via een activerend mutatie of via de invoering van overtollige gene kopieën) van de onderzochte functie. Voorwaartse mutagenese of systematische RNAi schermen zijn zonder vooroordelen op genfunctie en toestaan dat de onbevooroordeelde identificatie van genen die betrokken zijn in de functie van belang. Gezien de beschikbaarheid van genoom-brede RNAi voederen van Bibliotheken, kan bijna elk gen worden gemakkelijk neergeslagen door RNAi in C. elegans, zodanig dat enkel gen van belang of een andere groep van genen (bijvoorbeeldin gerichte schermen) kan ook worden snel gesondeerd voor hun effect in de benadering van een omgekeerde genetica. Om aan te tonen een mogelijke combinatie van benaderingen, hier beschrijven we een gerichte RNAi interactie scherm, beginnend met een winst-of-function cystic uitscheidingsmechanisme kanaal mutant, aangeduid met de cytoplasmatische kanaal groen fluorescente proteïne (GFP). De mutant fenotype werd gegenereerd door overexpressie van erm-1, een zeer geconserveerde C. elegans ortholog uit de linker membraan-actine Ezrin-Radixin-Moesin (ERM), die is betrokken bij lumen genuitdrukking en membraan organisatie in vele soorten12. C. elegans ERM-1 lokaliseert te lumenal membranen van inwendige organen, zoals de uitscheidingsmechanisme kanaal en de darm, en is vereist voor lumen vorming in beide13. ERM-1 overexpressie werft overtollige actine en blaasjes aan de gracht lumenal membraan, verhoging van de flux in de lumen en het genereren van een kort cystic kanaal en een gekruld lumenal membraan met verdikte actine ondervacht9. Het protocol wordt beschreven hoe u voor het genereren van transgene variëteiten met uitscheidingsmechanisme-kanaal-uitgedrukt label fusion eiwitten (of andere eiwitten); het uitvoeren van gerichte RNAi schermen beginnen met dergelijke stammen, te identificeren van de parameters van het fenotype van een kanaal; en hoe te visueel analyseren de resultaten van dergelijke schermen door fluorescentie ontleden en confocal microscopie, met inbegrip van eenvoudige manieren om te kwantificeren informatieve tubulogenesis fenotypen. Alternatief labeling technieken en de details van RNAi, aangepast aan de vaak dodelijke tubulogenesis genen, kan worden gevonden in het begeleidende document op intestinale tubulogenesis3. Alle methoden kunnen worden gebruikt in verschillende combinaties voor het onderzoek van andere vragen over kanaal tubulogenesis.

Protocol

1. het C. elegans Excretory kanaal labeling door fluorescerende Fusion eiwitten 14 Opmerking: Zie het begeleidende document op intestinale tubulogenesis 3 voor het labelen door in situ antilichaam kleuring procedures aan te passen aan het uitscheidingsmechanisme kanaal. Zie tabel 1 voor voorbeelden van moleculen bewezen nuttig voor het visualiseren van C. elegans uitscheidingsmechanisme kanaal endo- …

Representative Results

Dit protocol wordt beschreven hoe u de uitscheidingsmechanisme grachten van C. elegans visueel en moleculair analyseren eencellige tubulogenesis en intracellulaire lumen morfogenese in één cel. Tijdens hun uitbreiding uit de tijd van halverwege embryogenese naar volwassenheid blijven de vier uitscheidingsmechanisme grachten uitbreiden van hun basolaterale en apicaal/lumenal membranen samen met hun canalicular en endosomal endomembraansysteem, bieden een uniek model voor de …

Discussion

C. elegans genetische veelzijdigheid, transparantie, eenvoudige lichaam plan en invariant cel lineage alle maken het een uitstekend model voor de analyse van de voedselproductie. Dit protocol beschrijft hoe te combineren met standaard genetische manipulaties en beeldvorming studies om te profiteren van de 2 micron dun C. elegans uitscheidingsmechanisme grachten te studeren gepolariseerde membraan en intracellulaire lumen biogenese in de buis van een enkele cel.

Labele…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken M. Buechner (Universiteit van Kansas Kansas, USA), K. Nehrke (medisch centrum van de Universiteit van Rochester, Rochester, New York, USA) en de Caenorhabditis genetica Center, gefinancierd door de National Institutes of Health, Office van onderzoeksinfrastructuur Programma’s (P40 OD010440). Dit werk werd gesteund door subsidies NIH GM078653, MGH IS 224570 en 223809 van de stabilisatie-en associatieovereenkomst te V.G.

Materials

Cloning
Plasmid pPD95.75 Addgene Cat. No. 37464
PCR Kit Qiagen Cat. No. 27106
Ligation kit New England Biolabs Cat. No. E2611L
DNA marker Thermo Scientific Cat. No. SM1331
Agarose DNA grade Fisher Scientific Cat. No. BP164-100
Competent cells New England Biolabs Cat. No. C2987H
Tris Fisher Scientific Cat. No. BP154-1
EDTA Sigma Cat. No. ED-1KG
Acetic acid Fisher Scientific Cat. No. A38S-500
Ethidium bromide Fisher Scientific Cat. No. BP1302-10
Equipments
PCR machine  MJ Research Cat. No. PTG-200 
Centrifuge Eppendorf  Cat. No. 5415C
Water Bath Precision Scientific  Cat. No. 666A3 
Gel running instrument Fisher Scientific Cat. No. 09-528-165
Gel running power supply Fisher Scientific Cat. No. 45-000-465
Molecular Imager Gel Doc XR System Bio-Rad Cat. No. 1708195EDU
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific Cat. No. ND1000
C. elegans related1 1see reference27 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates2 2see reference24 for protocols.
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Yeast Extract BD Biosciences Cat. no. 212750
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
Ampicillin Sigma Cat. no. A0116
Tetracycline Fisher Scientific Cat. no. BP912
M9 Medium2 2see reference24 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
Na2HPO4 Sigma Cat. no. S7907
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
NGM plates 2 2see reference24 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Peptone  BD Biosciences Cat. no. 211677
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
CaCl2 Sigma Cat. no. C3881
Cholesterol  Sigma Cat. no. C8667
K2HPO4  Sigma Cat. no. P3786
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
RNAi plates3 3see reference60 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Peptone  BD Biosciences Cat. no. 211677
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
CaCl2 Sigma Cat. no. C3881
Cholesterol  Sigma Cat. no. C8667
K2HPO4  Sigma Cat. no. P3786
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
IPTG  US Biological Cat. no. I8500
Carbenicillin Fisher Scientific Cat. no. BP2648
NaOH Fisher Scientific Cat. no. SS266-1
Sodium hypochlorite Fisher Scientific Cat. no. 50371500
Bacteria
OP50 bacteria CGC
HT115 bacteria CGC
Genome-wide RNAi libraries
Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref29,49) Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref50) Source BioScience
Imaging related
Lidocaine MP Biomedicals,LLG Cat. no. 193917
Materials
Vacuum Grease Silicone Beckman Cat. no. 335148
Microscope slides  Fisher Scientific Cat. no. 4448
Microscope coverslips (22×22-1） Fisher Scientific Cat. no. 12-542-B
Tissue culture plate, 6 well  Corning Inc. Cat. no. 08-772-33
Equipment
SMZ-U dissecting microscope (Nikon)
SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions).
TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem)
C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lubarsky, B., Krasnow, M. A. Tube morphogenesis: making and shaping biological tubes. Cell. 112 (1), (2003).
  2. Sundaram, M. V., Cohen, J. D. Time to make the doughnuts: Building and shaping seamless tubes. Semin. Cell Dev. Biol. S1084-9521, 30130-30136 (2016).
  3. Zhang, N. The C. elegans intestine as a model for intercellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis at the single-cell level. JoVE. , (2017).
  4. Andrew, D. J., Ewald, A. J. Morphogenesis of epithelial tubes: Insights into tube formation, elongation, and elongation. Dev. Biol. 341 (1), 34-55 (2010).
  5. Nelson, F. K., Albert, P. S., Riddle, D. L. Fine structure of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system. J. Ultrastruct. Res. 82 (2), 156-171 (1983).
  6. Sundaram, M. V., Buechner, M. The Caenorhabditis elegans Excretory System: A Model for Tubulogenesis, Cell Fate Specification, and Plasticity. Genetics. 203 (1), 35 (2016).
  7. Altun, Z. F., Hall, D. H. Excretory system. WormAtlas. , (2009).
  8. Buechner, M. Tubes and the single C. elegans excretory cell. Trends Cell Biol. 12 (10), 479-484 (2002).
  9. Khan, L. A. Intracellular lumen extension requires ERM-1-dependent apical membrane expansion and AQP-8-mediated flux. Nat. Cell Biol. 15 (2), 143-156 (2013).
  10. Kolotuev, I., Hyenne, V., Schwab, Y., Rodriguez, D., Labouesse, M. A pathway for unicellular tube extension depending on the lymphatic vessel determinant Prox1 and on osmoregulation. Nat. Cell Biol. 15 (2), 157-168 (2013).
  11. Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Dev. Biol. 214 (1), 227-241 (1999).
  12. Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (4), 276-287 (2010).
  13. Gobel, V., Barrett, P. L., Hall, D. H., Fleming, J. T. Lumen morphogenesis in C. elegans requires the membrane-cytoskeleton linker erm-1. Dev. Cell. 6 (6), 865-873 (2004).
  14. Sambrook, J., Sambrook, J., DW, R. u. s. s. e. l. l. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2006).
  15. Fire, A., Harrison, S. W., Dixon, D. A modular set of lacZ fusion vectors for studying gene expression in Caenorhabditis elegans. Gene. 93 (2), 189-198 (1990).
  16. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  17. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  18. Pawley, J. B. . Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).
  19. Hibbs, A. R. . Confocal Microscopy for Biologists. , (2004).
  20. Bankhead, P. . Analyzing fluorescence microscopy images with ImageJ. , (2014).
  21. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157 (3), 1217-1226 (2001).
  22. Frøkjaer-Jensen, C. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).
  23. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).
  24. Barrangou, R. Cas9 Targeting and the CRISPR Revolution. Science. 344 (6185), 707-708 (2014).
  25. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
  26. Esposito, D., Garvey, L. A., Chakiath, C. S. Gateway cloning for protein expression. Methods Mol. Biol. 498, 31-54 (2009).
  27. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  28. Hobert, O. PCR fusion-based approach to create reporter gene constructs for expression analysis in transgenic C. elegans. Biotechniques. 32 (4), 728-730 (2002).
  29. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat. Rev. Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
  30. Berry, K. L., Bulow, H. E., Hall, D. H., Hobert, O. A. C. elegans CLIC-like protein required for intracellular tube formation and maintenance. Science. 302 (5653), 2134-2137 (2003).
  31. Mattingly, B. C., Buechner, M. The FGD homologue EXC-5 regulates apical trafficking in C. elegans tubules. Dev. Biol. 359 (1), 59-72 (2011).
  32. Shaye, D. D., Greenwald, I. The disease-associated formin INF2/EXC-6 organizes lumen and cell outgrowth during tubulogenesis by regulating F-actin and microtubule cytoskeletons. Dev. Cell. 32 (6), 743-755 (2015).
  33. Lant, B. CCM-3/STRIPAK promotes seamless tube extension through endocytic recycling. Nat. Commun. 6 (6), 6449 (2015).
  34. Paupard, M. C., Miller, A., Grant, B., Hirsh, D., Hall, D. H. Immuno-EM localization of GFP-tagged yolk proteins in C. elegans using microwave fixation. J. Histochem. Cytochem. 49 (8), 949-956 (2001).
  35. Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 885-891 (2005).
  36. Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
  37. Sherman, T. The abts and sulp families of anion transporters from Caenorhabditis elegans. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 289 (2), C341-C351 (2005).
  38. . Transgeneome website Available from: https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html (2017)
  39. . National BioResource Project (NBRP)::C. elegans Available from: https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/ (2017)
  40. Heppert, J. K. Comparative assessment of fluorescent proteins for in vivo imaging in an animal model system. Mol. Biol. Cell. 27 (22), 3385-3394 (2016).
  41. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  42. . BLAST Available from: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2017)
  43. Kamath, R. S., Martinezcampos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002 (2001).
  44. Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  45. Rual, J. F. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome research. 14 (10B), 2162-2168 (2004).

Tags

C. ElegansExcretory CanalIntracellular LumenPolarized Membrane BiogenesisTubulogenesisPolarityGFP FusionRNAiLive ImagingMembrane MarkersOrganelle MarkersPromotersERM-1Cystic Canal PhenotypeModifier Screen
check_url/56101?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhang, N., Membreno, E., Raj, S., Zhang, H., Khan, L. A., Gobel, V. The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging. J. Vis. Exp. (128), e56101, doi:10.3791/56101 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image