Syntesen av infektiös bakteriofager i en E. coli -baserade Cell-free uttryck systemet
Summary
En ny generation av cellfria transkription-översättning plattformar har konstruerats för att konstruera biokemiska system i vitro genom utförandet av genen kretsar. I den här artikeln beskriver vi hur bakteriofager, såsom MS2, ΦΧ174 och T7, syntetiseras från deras arvsmassa som använder ett alla E. coli cell-fri TXTL system.
Abstract
En ny generation av cellfria transkription-översättning (TXTL) system, konstruerad så att en större mångsidighet och modularitet, ger nya möjligheter att utföra grundläggande och tillämpad vetenskap i provrör reaktioner. Under det senaste årtiondet blivit cell-fri TXTL en kraftfull teknik för ett brett spektrum av romanen tvärvetenskaplig forskning områden relaterade till kvantitativa och syntetisk biologi. De nya TXTL-plattformarna är särskilt användbara för att konstruera och förhöra biokemiska system genom utförandet av syntetiska eller naturliga gen kretsar. In vitro TXTL har visat sig vara praktiskt att snabbt prototypen reglerande element och biologiska nätverk samt att recapitulate molekylär självmontering mekanismer finns i levande system. I den här artikeln beskriver vi hur smittsam bakteriofager, såsom MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA), och T7 (dsDNA), syntetiseras helt från sin arvsmassa i one-pot reaktioner med en alla Escherichia coli, cell-fri TXTL system. Syntesen av de tre coliphages kvantifieras med plack-analys. Vi visar hur avkastningen av syntetiserade phage beror på biokemiska inställningarna av reaktionerna. Molekylär trängsel, emuleras genom en kontrollerad koncentration av PEG 8000, påverkar mängden syntetiserade fagocyt genom beslut av magnituder. Vi beskriver också hur du förstärker Fager och att rena sin arvsmassa. Uppsättningen protokoll och resultat som presenteras i detta arbete bör vara av intresse för tvärvetenskapliga forskare involverade i cellfria syntetisk biologi och bioteknik.
Introduction
Under det senaste årtiondet, har cellfria uttryck tekniken utvecklats till adress nya tillämpningar i framväxande tvärvetenskaplig forskning områden relaterade till syntetiska och kvantitativ biologi. Ursprungligen används för att uttrycka proteiner oberoende av en levande organism, har nya cellfria TXTL system utvecklats för både grundläggande och tillämpad vetenskap1,2, avsevärt utvidga omfattningen av denna teknik. Den nya generationen av TXTL plattformar har utformats för att vara användarvänlig, effektivare (når 2 mg/mL av proteinsyntesen i batch-läge3), mer mångsidig i nivå med transkription4, och modulär så att enkelt integrera roman naturliga eller syntetiska funktioner som utökar funktionerna i befintliga biologiska system5,6. I synnerhet blivit cellfria TXTL system händig för den rapid prototyping av genetiska program, till exempel föreskrivande element eller små genetiska kretsar7,8,9, genom att minska det design-build-testet cykla till några dagar. Anmärkningsvärt är är de nya TXTL-systemen också kan bearbeta stora DNA program såsom komplett syntesen av coliphages10,11, visar stark nog föreställningar till stöd för beredning av aktiv genomisk DNA-kodad levande enheter.
TXTL systems presenterar många tekniska fördelar jämfört med traditionella in vitro- konstruktiv biokemiska analyser. Cell-fri TXTL länkar processen av genuttryck till den slutliga produkten i en reducerad och öppen miljö, i motsats till komplexa cytoplasman i en levande cell. TXTL använder DNA rekonstruera biokemiska system i vitro, vilket med moderna tekniker för DNA-församling, är prisvärd och snabb förutom att inte kräva kräset protein reningssteg. Cellfria uttryck ger direkt tillgång till de flesta komponenter i de biokemiska reaktioner, vilket möjliggör en djupare dissektion av molekylära interaktioner12. I en TXTL reaktion, kan man ändra de biokemiska och biofysiska inställningarna på vilja, vilket är nästan omöjligt i en levande cell. Med tanke på dessa fördelar och senaste förbättringar, blir TXTL tekniken mer och mer populärt som en alternativ plattform för syntetiska och kvantitativ biologi. Medan forskning gemenskapen med hjälp av TXTL växer snabbt och TXTL blir en standardteknik i bioteknik, är det viktigt att förstå hur man använder sådana plattformar för att utveckla lämpliga metoder relaterade till verkställandet av TXTL reaktioner och till den tolkning av resultaten.
I den här artikeln beskriver vi hur du använder en alla E. coli TXTL systemet för att syntetisera, i one-pot reaktioner, bakteriofager från deras arvsmassa11, såsom MS2 (RNA, 3.4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5.4 kb), och T7 (dsDNA, 40 kb). Vi visar hur mängden fagocyt syntetiseras ändringarna med avseende på några av de biokemiska reaktionerna (magnesium och kalium koncentrationer). Molekylär trängsel, emuleras genom ett utbud av PEG 8000 koncentrationerna, har en dramatisk effekt på phage syntes över flera tiopotenser. Förverkligandet av sådana stora biokemiska system i enda provrör reaktioner som recapitulate samtidigt processerna för transkription, översättning, och självmontering, är intressant för att ta itu med grundläggande frågor om biologi och biofysik 10 (genreglering, självmontering), såväl som för att utveckla applikationer, såsom återanvända phage funktioner för att bygga nya nanostrukturer13. Förutom en praktisk på TXTL och tillhandahåller vi metoder för phage förstärkning, genomet extraktion och rening och phage kvantifiering av plack analysen. De metoder som presenteras i detta manuskript är lämpliga för forskare som använder E. coli extrakt baserat cellfria system och är intresserad av bakteriofager.
De protokoll som presenteras i detta arbete kan sammanfattas som följer: 1) Phage amplifiering (dag 1: förbereda inympning celler, dag 2: enda plack, flera phage tillväxt, och koncentration och dag 3: rening av phage), 2) dubbelsträngat arvsmassan DNA-extraktion (fenol/kloroform extraktion), och 3) Cell-free phage reaktion och antikroppnivåns experiment (dag 1: tallrik värdceller och göra agarplattor, dag 2: cellfria reaktion och mottagande cell före kultur och dag 3: värd cell kultur och phage titer).
Protocol
Representative Results
Discussion
Efter tekniken i Chen, o.a. 14 för SPMC, ett kritiskt steg uppnås vid fastställandet av rätt förutsättningar för superinfektion. Parametern som närmast styr en värd Stams förmåga att motstå superinfektion är ofta den ursprungliga koncentrationen av den infekterande phage. De mottagande cellerna måste vara i logaritmisk tillväxtfas innan första infektion med en mycket liten mängd phage. Så småningom phage når också logaritmisk tillväxt och målet är att tillåta phag…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta material bygger på arbete som stöds av Office of Naval Research award nummer N00014-13-1-0074 (V.N.), Human Frontier Science programmet bevilja nummer 2015-RGP0037 (V.N.) och den binationella Science Foundation ger 2014400 (till V.N.).
Materials
| Ultracentrifugation tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
| Conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Gradient maker | BioComp Gradient Master | see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9. | |
| Syringe and Blunt Cannula | Monoject | 8881513918 and 888202017 | |
| Wide-bore pipette tips | Fischerbrand | 02-707-134 | |
| Plaque counter | New Brunswik Scientific | Colony Counter Model C-110 | |
| Culture tubes | Fischerbrand | 14-961-33 | |
| Cell-free system | Mycroarray Inc | Mytxtl | |
| BioComp Gradient Master | BioComp Instruments | Model 105ME | |
| LB agar plate recipe | 25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller – Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company – product number 214010). |
References
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol Adv. , (2011).
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metab Eng. , (2011).
- Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/mL of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
- Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synth Biol. 1 (1), 29-41 (2012).
- Chemla, Y., Ozer, E., Schlesinger, O., Noireaux, V., Alfonta, L. Genetically expanded cell-free protein synthesis using endogenous pyrrolysyl orthogonal translation system. Biotechnol Bioeng. , (2015).
- Hong, S. H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis. Frontiers in Chemistry. 2, (2014).
- Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12672-12677 (2003).
- Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for Rapid Prototyping of Synthetic Biological Circuits in an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free System. Acs Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).
- Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. , (2015).
- Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction. ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).
- Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth Biol. , (2016).
- Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system. Phys Rev Lett. 106 (4), 048104 (2011).
- Daube, S. S., Arad, T., Bar-Ziv, R. Cell-free co-synthesis of protein nanoassemblies: tubes, rings, and doughnuts. Nano Lett. 7 (3), 638-641 (2007).
- Chen, X., et al. An immunoblot assay reveals that bacteriophage T4 thymidylate synthase and dihydrofolate reductase are not virion proteins. J Virol. 69 (4), 2119-2125 (1995).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762 (2013).
- Shin, J. N. V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. J Biol Eng. , (2010).
- Caschera, F., Noireaux, V. Preparation of amino acid mixtures for cell-free expression systems. Biotechniques. 58 (1), 40-43 (2015).
- Minton, A. P. How can biochemical reactions within cells differ from those in test tubes. J Cell Sci. 119, 2863-2869 (2006).
- Minton, A. P. Implications of macromolecular crowding for protein assembly. Curr Opin Struct Biol. 10 (1), 34-39 (2000).
- Zimmerman, S. B., Minton, A. P. Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 22, 27-65 (1993).
