Integrationsfri avledning av humana inducerade plöripotenta stamceller med användning av Laminin 521 Matrix
Summary
Robust avledning av humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPS) -celler uppnåddes genom att icke-integrera Sendai-virus (SeV) -vektor-medierad omprogrammering av dermala fibroblaster uppnåddes. HiPS-cellunderhåll och klonal expansion utfördes med användning av xenofria och kemiskt definierade odlingsbetingelser med rekombinant human laminin 521 (LN-521) matris och essentiell E8 (E8) -medium.
Abstract
Xenofria och fullständigt definierade betingelser är nyckelparametrar för robust och reproducerbar generation av homogena humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPS) celler. Underhåll av hiPS-celler på matarceller eller odefinierade matriser är mottagliga för batchvariationer, patogen kontaminering och risk för immunogenicitet. Genom att utnyttja den definierade rekombinanta humana laminin 521 (LN-521) matrisen i kombination med xenofria och definierade medieformuleringar reducerar variabiliteten och möjliggör konsekvent generation av hiPS-celler. Sendai-viruset (SeV) -vektorn är ett icke-integrerande RNA-baserat system, varigenom omständigheter som förknippas med den potentiella störande effekten på genomintegritet integrationsvektorer kan ha. Vidare har dessa vektorer visat relativt hög effektivitet vid omprogrammeringen av dermala fibroblaster. Dessutom underlättar enzymatisk cellcellerpassage av celler homogent underhåll av hiPS-celler utan betydande tidigare erfarenhet av stamcellerLl kultur. Här beskrivs ett protokoll som har testats omfattande och utvecklats med fokus på reproducerbarhet och användarvänlighet, vilket ger ett robust och praktiskt sätt att generera definierade och xenofria humana hiPS-celler från fibroblaster.
Introduction
Sedan den första avledningen av hiPS-cellinjer av Takahashi et al. 1 , 2 , hiPS-celler har tillhandahållit ett användbart verktyg för sjukdomsmodellering, läkemedelsupptäckt och som källmaterial för att generera cellterapier i regenerativ medicin 3 . HiPS-cellodling har länge varit beroende av samkultur med fibroblastmatarceller 4 , 5 eller på Matrigel 6 och med medieformuleringar innehållande fetalt bovint serum (FBS). Batch-to-batch-variationer är en vanlig följd av de odefinierade egenskaperna hos dessa odlingsförhållanden, vilket resulterar i oförutsägbara variationer, vilket är en viktig bidragande till otillförlitligheten av dessa protokoll 7 . Utvecklingen av definierat medium, såsom essentiella 8 (E8) 8 och definierade cellodlingsmatriser, exempelvis LN-521 9 , tillåterS för upprättandet av höggradigt reproducerbara protokoll och stöd i den robusta generationen och upprätthållandet av homogena hiPS-celler 7 , 8 , 9 , 10 .
Utveckling av integrationsfri omprogrammeringsteknik har varit ett steg framåt. Ursprungligen var omprogrammeringen beroende av retrovirala vektorer som slumpmässigt integrerades i genomet med störande effekter på genomisk integritet 11 . Förskott i omprogrammeringsmetoder innefattar utveckling av RNA-baserade vektorer. RNA-vektorer har en fördel jämfört med den DNA-baserade omprogrammeringsmetoden eftersom oavsiktlig integration genom genomisk rekombination inte är möjlig 12 . SeV-vektorer tillhandahåller högt och övergående uttryck av exogena faktorer genom enkelsträngad RNA utan en DNA-fas 11 . De omprogrammerande vektorerna som levereras av SeVSpädas ut genom cellexpansion och slutligen skjulas från kulturen, vilket ger ett fotoprintsfritt sätt att omprogrammera. Därefter är underhåll av pluripoten beroende av endogent uttryck av pluripotensgenerna 2 .
Som banbrytande hiPS-cellbaserade terapier börjar inflyta i kliniska prövningar är kraven på standardiserade partier, reproducerbarhet och säkerhet viktiga frågor för att ta itu med 13 . Därför bör produkter av animaliskt ursprung undvikas. Till exempel har användningen av xenogena produkter associerats med risk för icke-humant patogenförorening. Celler som odlats i närvaro av animaliska härledda odlingskomponenter har också visat sig inkorporera icke-humana silikasyror i cellmembran som hotar att göra härledda celler immunogena 14 . Därför är behovet av att eliminera xenogena produkter nödvändigt för framtida kliniska sysslor. Detta protokoll gäller xeIngen fri och definierad kultur vid underhållet av hiPS-celler flyttar celler närmare klinisk överensstämmelse.
Detta protokoll beskriver en konsekvent, mycket reproducerbar och lättanvänd metod som genererar standardiserade hiPS-celler från fibroblaster. Det erbjuder också ett användarvänligt kultursystem för underhåll av etablerade HiPS-celler. Detta protokoll har använts för att härleda mer än 300 hiPS-cellinjer i den svenska nationella mänskliga iPS Core-anläggningen vid Karolinska Institutet, av vilka några linjer tidigare har beskrivits 15 , 16 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Det förväntade resultatet av detta protokoll är den framgångsrika generationen av flera klonalt härledda hiPS-cellinjer. Viktigt är att metoden för underhåll och expansion av etablerade hiPS-celler som beskrivs här är pålitlig och kan utföras med liten tidigare erfarenhet av stamcellerkulturen. Enzymatisk enkelcellspassaging med ROCKi tillsammans med LN-521-matrisen är känd för att upprätthålla cellerna som karyotypiskt normala, pluripotenta och lätt kan differentiera samtidigt som man undviker inducer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av SSF (B13-0074) och VINNOVA (2016-04134) finansieringsagenter.
Materials
| Dispase | Life Technologies | 171105-041 | Biopsy digestion |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Biopsy digestion |
| Gelatin | Sigma | G1393 | Fibroblast matrix |
| IMDM | Life Technologies | 21980002-032 | Fibroblast medium |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | Fibroblast medium |
| PenicillinStreptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Antibiotic |
| Essential 8 media | ThermFisher Scientific | A1517001 | iPS cell culture media |
| LN-521 | Biolamina | LN521-03 | iPS cell culture matrix |
| TrypLE select 1X | ThermoFisher Scientific | 12563011 | Dissociation reagent |
| Rho-kinase inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | Rho-kinase inhibitor (ROCKi) |
| CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit | Life Technologies | A1377801 | Sendai virus reprogramming vector |
| 35 mm tissue culture dish | Sarstedt | 83.3900.300 | Cell culture |
| 60 mm tissue culture dishes | Sarstedt | 83.3901.300 | Cell culture |
| 24 well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3922.300 | Cell culture |
| T25 tissue culture flasks | VWR | 734-2311 | Cell culture |
| 15 ml tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tubes |
| 1.5 ml tube | Eppendorf | 0030123.301 | 1.5 ml tube |
| CoolCell cell LX | Biocision | BCS-405 | Freezing container |
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | Fibroblast freezing |
| Cryovials 1.8 ml | VWR | 479-6847 | Cryovials |
| PSC Cryopreservation Kit | Gibco | A2644601 | PSC CryomediumRevitaCell supplement |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | ThermoFisherScientific | 25300054 | Fibroblast dissociation enzyme |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 31331-028 | Digestive enzymes dilutant |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | PBS |
| HBSS | ThermoFIsher Scientific | 14025-050 | Biopsy preparation |
| Haemocytometer | Sigma | BRAND, 718920 | Cell counting |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. Integration-free induced pluripotent stem cells derived from retinitis pigmentosa patient for disease modeling. Stem Cells Transl Med. 1 (6), 503-509 (2012).
- Zhou, H., Ding, S. Evolution of induced pluripotent stem cell technology. Curr Opin Hematol. 17 (4), 276-280 (2010).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum Reprod. 18 (7), 1404-1409 (2003).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
- Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotech. 28 (6), 611-615 (2010).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8 (5), 424-429 (2011).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nat Commun. 5, 3195 (2014).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
- Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Unger, C., Skottman, H., Blomberg, P., Dilber, M. S., Hovatta, O. Good manufacturing practice and clinical-grade human embryonic stem cell lines. Hum Mol Genet. 17 (R1), R48-R53 (2008).
- Martin, M. J., Muotri, A., Gage, F., Varki, A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med. 11 (2), 228-232 (2005).
- Kele, M., et al. Generation of human iPS cell line CTL07-II from human fibroblasts, under defined and xeno-free conditions. Stem Cell Research. 17 (3), 474-478 (2016).
- Uhlin, E., et al. Derivation of human iPS cell lines from monozygotic twins in defined and xeno free conditions. Stem Cell Research. 18, 22-25 (2017).
- . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2009)
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
- Jacobs, K., et al. Higher-Density Culture in Human Embryonic Stem Cells Results in DNA Damage and Genome Instability. Stem Cell Reports. 6 (3), 330-341 (2016).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotech. 33 (1), 58-63 (2015).
- . Ideal Xeno-Free Culture Conditions For Human Fibroblasts That Facilitate Efficient Reprogramming Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf (2016)
- Trokovic, R., Weltner, J., Noisa, P., Raivio, T., Otonkoski, T. Combined negative effect of donor age and time in culture on the reprogramming efficiency into induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 15 (1), 254-262 (2015).
