Integreringsfri avledning av humane inducerte pluripotente stamceller ved bruk av Laminin 521 Matrix
Summary
Robust avledning av humant indusert pluripotent stamceller (hiPS) celler ble oppnådd ved å bruke ikke-integrering av Sendai virus (SeV) vektor-mediert omprogrammering av dermale fibroblaster. HiPS-cellevedlikehold og klonal ekspansjon ble utført ved hjelp av xenofri og kjemisk definerte kulturbetingelser med rekombinant human laminin 521 (LN-521) matriks og essensielt E8 (E8) medium.
Abstract
Xenofrie og fullt definerte forhold er nøkkelparametere for robust og reproducerbar generering av homogene humane induserte pluripotente stamceller (hiPS) celler. Vedlikehold av hiPS-celler på materceller eller udefinerte matriser er utsatt for batchavvik, patogen forurensning og risiko for immunogenicitet. Ved å benytte den definerte rekombinante humane laminin 521 (LN-521) matrisen i kombinasjon med xenofri og definerte mediaformuleringer, reduseres variabiliteten og muliggjør konsistent generering av hiPS-celler. Sendai-viruset (SeV) -vektoren er et ikke-integrasjonsbasert RNA-basert system, og dermed omgå bekymringer forbundet med den potensielle forstyrrende effekten på genomets integritet integrering vektorer kan ha. Videre har disse vektorene vist relativt høy effektivitet ved omprogrammeringen av dermale fibroblaster. I tillegg letter enzymatisk enkelcellepassering av celler homogen vedlikehold av hiPS-celler uten betydelig tidligere erfaring med stamcellerLl kultur. Her beskriver vi en protokoll som er grundig testet og utviklet med fokus på reproduserbarhet og brukervennlighet, og gir en robust og praktisk måte å generere definerte og xenofri humane hiPS-celler fra fibroblaster.
Introduction
Siden den første avledning av hiPS-cellelinjer av Takahashi et al. 1 , 2 , hiPS-celler har gitt et nyttig verktøy for sykdomsmodellering, medikamentfunn og som kildemateriale for generering av celleterapier i regenerativ medisin 3 . HiPS-cellekultur har lenge vært avhengig av samkultur med fibroblastføderceller 4 , 5 eller på Matrigel 6 og med mediaformuleringer inneholdende føtalt bovint serum (FBS). Batch-to-batch-avvik er en vanlig følge av de ubetingede egenskapene til disse kulturbetingelsene, noe som resulterer i uforutsigbare variasjoner, noe som er en viktig bidragsyter til upålitigheten til disse protokollene 7 . Utviklingen av definert medium slik som essensielle 8 (E8) 8 og definerte cellekulturmatriser, for eksempel LN-521 9 , tillaterS for etablering av svært reproduserbare protokoller og hjelpemiddel ved robust generering og vedlikehold av homogene HiPS-celler 7 , 8 , 9 , 10 .
Utvikling av integrasjonsfri omprogrammeringsteknikker har vært et sprang fremover. Opprinnelig var omprogrammering avhengig av retrovirale vektorer som tilfeldigvis integrerte i genomet med forstyrrende effekter på genomisk integritet 11 . Fremskritt i omprogrammeringsmetoder inkluderer utvikling av RNA-baserte vektorer. RNA-vektorer har en fordel i forhold til den DNA-baserte omprogrammeringsmetoden som utilsiktet integrasjon gjennom genomisk rekombination er ikke mulig 12 . SeV-vektorer gir høy og forbigående ekspresjon av eksogene faktorer gjennom enkeltstrenget RNA uten en DNA-fase 11 . De omprogrammerende vektorer levert av SeVBlir fortynnet gjennom celleutvidelse og til slutt skuret fra kultur som gir en fotgjengerfri måte å omprogrammere. Deretter er vedlikehold av pluripoten avhengig av endogen ekspression av pluripoten-genene 2 .
Som banebrytende hiPS-cellebaserte terapier begynner å bevege seg i kliniske studier, er kravene til standardiserte batcher, reproduserbarhet og sikkerhet viktige problemer for å ta opp 13 . Derfor bør produkter av animalsk opprinnelse unngås. For eksempel har bruken av xenogene produkter vært forbundet med risiko for ikke-humant patogenforurensning. Også celler som er dyrket i nærvær av dyreavledede kulturkomponenter, har vist seg å inkorporere ikke-humane silisiumsyrer i cellemembraner som truer med å gjøre avledte celler immunogene 14 . Derfor er behovet for å eliminere xenogene produkter nødvendig for fremtidige kliniske sysler. Denne protokollen gjelder xeIngen fri og definert kultur i vedlikehold av hiPS-celler beveger celler nærmere klinisk overholdelse.
Denne protokollen beskriver en konsekvent, svært reproduserbar og brukervennlig metode som genererer standardiserte hiPS-celler fra fibroblaster. Det tilbyr også et brukervennlig kultursystem for vedlikehold av etablerte hiPS-celler. Denne protokollen har blitt brukt til å utlede mer enn 300 hiPS-cellelinjer i det svenske nasjonale menneskelige iPS Core-anlegget ved Karolinska Institutet, hvorav noen linjer tidligere er beskrevet 15 , 16 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Det forventede resultatet av denne protokollen er den vellykkede generasjonen av flere klonalt avledede hiPS-cellelinjer. Viktig er fremgangsmåten for vedlikehold og utvidelse av etablerte hiPS-celler som er beskrevet her, pålitelig og kan utføres med liten tidligere erfaring med stamcellekultur. Enzymatisk enkelcellepassasje med ROCKi sammen med LN-521-matrisen er kjent for å opprettholde celler som karyotypisk normal, pluripotent og lett i stand til å differensiere samtidig som indukt heterogenitet at kolonibaser…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av SSF (B13-0074) og VINNOVA (2016-04134) finansieringsagenter.
Materials
| Dispase | Life Technologies | 171105-041 | Biopsy digestion |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Biopsy digestion |
| Gelatin | Sigma | G1393 | Fibroblast matrix |
| IMDM | Life Technologies | 21980002-032 | Fibroblast medium |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | Fibroblast medium |
| PenicillinStreptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Antibiotic |
| Essential 8 media | ThermFisher Scientific | A1517001 | iPS cell culture media |
| LN-521 | Biolamina | LN521-03 | iPS cell culture matrix |
| TrypLE select 1X | ThermoFisher Scientific | 12563011 | Dissociation reagent |
| Rho-kinase inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | Rho-kinase inhibitor (ROCKi) |
| CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit | Life Technologies | A1377801 | Sendai virus reprogramming vector |
| 35 mm tissue culture dish | Sarstedt | 83.3900.300 | Cell culture |
| 60 mm tissue culture dishes | Sarstedt | 83.3901.300 | Cell culture |
| 24 well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3922.300 | Cell culture |
| T25 tissue culture flasks | VWR | 734-2311 | Cell culture |
| 15 ml tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tubes |
| 1.5 ml tube | Eppendorf | 0030123.301 | 1.5 ml tube |
| CoolCell cell LX | Biocision | BCS-405 | Freezing container |
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | Fibroblast freezing |
| Cryovials 1.8 ml | VWR | 479-6847 | Cryovials |
| PSC Cryopreservation Kit | Gibco | A2644601 | PSC CryomediumRevitaCell supplement |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | ThermoFisherScientific | 25300054 | Fibroblast dissociation enzyme |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 31331-028 | Digestive enzymes dilutant |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | PBS |
| HBSS | ThermoFIsher Scientific | 14025-050 | Biopsy preparation |
| Haemocytometer | Sigma | BRAND, 718920 | Cell counting |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. Integration-free induced pluripotent stem cells derived from retinitis pigmentosa patient for disease modeling. Stem Cells Transl Med. 1 (6), 503-509 (2012).
- Zhou, H., Ding, S. Evolution of induced pluripotent stem cell technology. Curr Opin Hematol. 17 (4), 276-280 (2010).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum Reprod. 18 (7), 1404-1409 (2003).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
- Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotech. 28 (6), 611-615 (2010).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8 (5), 424-429 (2011).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nat Commun. 5, 3195 (2014).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
- Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Unger, C., Skottman, H., Blomberg, P., Dilber, M. S., Hovatta, O. Good manufacturing practice and clinical-grade human embryonic stem cell lines. Hum Mol Genet. 17 (R1), R48-R53 (2008).
- Martin, M. J., Muotri, A., Gage, F., Varki, A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med. 11 (2), 228-232 (2005).
- Kele, M., et al. Generation of human iPS cell line CTL07-II from human fibroblasts, under defined and xeno-free conditions. Stem Cell Research. 17 (3), 474-478 (2016).
- Uhlin, E., et al. Derivation of human iPS cell lines from monozygotic twins in defined and xeno free conditions. Stem Cell Research. 18, 22-25 (2017).
- . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2009)
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
- Jacobs, K., et al. Higher-Density Culture in Human Embryonic Stem Cells Results in DNA Damage and Genome Instability. Stem Cell Reports. 6 (3), 330-341 (2016).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotech. 33 (1), 58-63 (2015).
- . Ideal Xeno-Free Culture Conditions For Human Fibroblasts That Facilitate Efficient Reprogramming Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf (2016)
- Trokovic, R., Weltner, J., Noisa, P., Raivio, T., Otonkoski, T. Combined negative effect of donor age and time in culture on the reprogramming efficiency into induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 15 (1), 254-262 (2015).
