Derivación de líneas de células madre de embriones de preimplantación de ratón

Summary

Este artículo describe un protocolo y eficiente derivar líneas de células madre pluripotentes de embriones de ratón de la cultura en la etapa de blastocisto.

Abstract

Derivación de células madre embrionarias (mESC) de ratón es el proceso por que pluripotentes se establecen líneas celulares de embriones de preimplantación. Estas líneas conservan la capacidad de autorrenovación o diferenciar bajo condiciones específicas. Debido a estas propiedades, mESC son una herramienta útil en la medicina regenerativa, modelado de la enfermedad y estudios de ingeniería de tejidos. Este artículo describe un protocolo simple para obtener líneas mESC con eficiencias de derivación alta (60-80%) por cultivo de blastocistos de cepas permisivas ratón células de alimentador en definido suplementado con factor inhibidor de leucemia. El protocolo se puede aplicar también para derivar eficazmente mESC líneas de cepas de ratón no permisiva, por la simple adición de una combinación de dos inhibidores de molécula pequeña al derivación medio (2i). Se proporcionan procedimientos detallados sobre la preparación y cultivo de células de alimentador, recolección y cultivo de embriones de ratón y derivación y cultura de mESC líneas. Este protocolo no requiere equipo especializado y puede realizarse en cualquier laboratorio con experiencia en cultivo células de mamífero básico.

Introduction

Las células madre embrionarias (ESC) son células pluripotentes derivadas de embriones preimplantación, que conservan la capacidad de autorrenovación o diferenciar bajo condiciones específicas¹. Partiendo de estas propiedades, ESC se han convertido en una herramienta útil para la medicina regenerativa, modelado de la enfermedad y tejido ingeniería estudios².

ESC se derivan por primera vez embriones de preimplantación ratón, origina líneas ESC (mESC) de ratón con éxito bajo^3,4. Durante años, la eficacia de la derivación seguía siendo baja debido a la dificultad de mantenimiento de la pluripotencia in vitro. Además de la presencia de alimentador células⁵, que mejorar la eficiencia de la derivación, promover la fijación de la Colonia y mejorar estabilidad cariotípica⁶, varias modificaciones del protocolo conducen a una mejora en el mantenimiento de la pluripotencia. El más importantes eran la adición de Factor inhibitorio de leucemia (LIF) para mESC medio de cultivo^7,8, el uso de embriones de la 129S2 fondo permisiva⁹ y define la cultura de la mESC con suplementado con suero, libre de potenciales factores de diferenciación¹⁰. Más recientemente, convincente evidencia ha demostrado que la adición de un cóctel de dos moduladores de molécula pequeña de vías de señalización al medio de cultivo mESC (conocido como 2i) es mejor mantener la pluripotencialidad. El 2i cóctel consiste en una combinación de inhibidor de la MEK PD0325901, que reduce las señales de diferenciación mediante la inhibición de la vía de la quinasa (MAPK) de proteína mitogen-activados, y el inhibidor de la GSK3β CHIR99021, que mejora la supervivencia de la célula a baja densidad mediante la activación de la vía Wnt del¹¹.

En el presente artículo, se describe un protocolo simple para derivar eficazmente mESC líneas de blastocistos de ratón. Seguimos procedimientos estándar, cultivo de embriones de cepas permisivas en las células de alimentador en medio de la derivación con LIF y un recambio de suero¹². Siguiendo este protocolo, mESC líneas puede derivarse con rendimientos equivalentes a las obtenidas en medio 2i. A pesar de esto, pueden agregarse 2i para evitar posibles problemas con el mantenimiento de la pluripotencia o cuando se trabaja con cepas no permisiva.

Protocol

el uso de los animales descritos en las secciones a continuación ha sido aprobado por el Comité de ética Animal y de la investigación humana de la Universitat Autònoma de Barcelona y por el Departamento d ' Agricultura, Ramaderia, Pesca Alimentació de la Generalitat de Catalunya (protocolo #8741). 1. inactivación de células de alimentador y almacenamiento Nota: fibroblastos de prepucio humano (HFF-1) fueron congelados previamente en 1 mL de la solución…

Representative Results

Siguiendo este protocolo, debe lograrse más 95% de la formación del fruto después de la primera semana de la cultura (figura 1A). Establecimiento de líneas de la mESC luego de seis pasos es variable entre los distintos recipientes experimentales, con un éxito promedio de 60-80%. La adición de 2i no mejora significativamente los resultados cuando se trabaja con cepas de ratón permisiva, como aquellas con antecedentes de 129S2, pero es necesario cuando s…

Discussion

Aunque mESC línea derivación es un procedimiento bien conocido en muchos laboratorios utilizado habitualmente, su eficiencia no siempre es tan alta como se esperaba debido a los múltiples factores que pueden perturbar el mantenimiento de la pluripotencia. En el presente artículo mostramos, paso a paso, cómo establecer líneas mESC con alta eficiencia utilizando un protocolo sencillo y fiable. Estas eficiencias son similares a los reportados en la literatura.

Para asegurar la máxima efici…

Materials

1 mL sryringe	BD	309628
2-β-mercaptoethanol	Life Technologies	31350-010
4-well plate	Thermo Scientific Nunc	176740
Acidic Tyrode's solution	Home-made		See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4ºC. Alternatively, for long-term storage keep it at -20ºC. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M.
BSA	Sigma	A3311
Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488	Molecular Probes – Invitrogen	A-21200	1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, αSMA and AFP mouse antibodies.
CHIR990212	Axon Medchem	1386	Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles.
CryoTube	Thermo Scientific Nunc	3754518
DMSO	Sigma	41640
DMEM	BioWest	L0107
FBS	BioWest	S1810	Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56ºC. Aliquot and store at -20ºC
Flushing needle	BD	304000	Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone
Gelatin from porcine skin	Fluka	48724	Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month.
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594	Molecular Probes – Invitrogen	A-11037	1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody.
HBSS	BioWest	L0611
Hepes-buffered CZB	Home-made		See composition in Chatot et al, 1989
Human chorionic gonadotropin	Divasa-Farmavic	Veterin-Corion 3000 UI	Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again.
Human foreskin fibroblasts	ATCC	ATCCSCRC-1041	For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen.
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20ºC (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles.
KSOMaag Evolve	Zenith Biotech	ZEKS-050	Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37ºC and 5% CO2 a day prior to use.
Leukemia Inhibitory Factor	Merk Millipore	ESG1106
Mice	Charles River/Harlan		It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor.
Mineral oil	Sigma	M8410	Embryo tested. Photosensitive.
Mitomycin C	Serva	2980501	Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4ºC protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer.
Mouse anti-tubulin β III (Tuj1)	Biolegend	MMS-435P	1:500 dilution
Mouse monoclonal anti-αSMA	Sigma	A5228	1:200 dilution
Mouse monoclonal anti-AFP	R&D Systems	MAB1368	1:50 dilution
Mouse monoclonal anti Oct3/4	Santa cruz	Sc-5279	1:50 dilution
Non-Essential Amino Acids	Life Technologies	11140-035
PD0325901	Axon Medchem	1408	Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles.
Petri dish (35mm)	Thermo Scientific Nunc	153066
Petri dish (60mm)	Thermo Scientific Nunc	150288
Pregnant mare's serum gonadotropin	Foligon	Foligon-1000 UI	Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again.
Rabbit policlonal anti-Sox2	Merck Millipore	AB5603	1:200 dilution
T75 falcon	Thermo Scientific	130190
Trypsin-EDTA 10x	BioWest	X0930	Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution