Afleiding van stamcellijnen uit muis voor inplanting embryo 's
Summary
Dit artikel beschrijft een protocol om efficiënt ontlenen en cultuur pluripotente stamcellijnen uit muis embryo’s in het blastocyst stadium.
Abstract
Muis embryonale stamcellen (mESC) afleiding is het proces door welke pluripotente cellijnen van voor inplanting embryo’s zijn gevestigd. Deze lijnen behouden de mogelijkheid om zelf vernieuwen of onderscheid onder bepaalde voorwaarden. Als gevolg van deze eigenschappen, mESC vormen een nuttig instrument in regeneratieve geneeskunde, ziekte modellering en weefsel engineering studies. Dit artikel beschrijft een eenvoudig protocol om te verkrijgen mESC lijnen met hoge afleiding efficiëntie (60-80%) door kweken blastocysten van permissieve muis stammen op feeder cellen in beschreven medium aangevuld met leukemie remmende factor. Het protocol kan ook worden toegepast om efficiënt mESC lijnen ontlenen in niet-tolerante muis stammen, door de eenvoudige toevoeging van een cocktail van twee kleine-molecuul remmers aan het medium van de afleiding (2i medium). Gedetailleerde procedures over de opstelling en de cultuur van feeder cellen, verzameling en cultuur van muis embryo’s, en afleiding en de cultuur van mESC lijnen zijn bestemd. Dit protocol vereist geen speciale apparatuur en kan worden uitgevoerd in een laboratorium met eenvoudige zoogdieren cel cultuur expertise.
Introduction
Embryonale stamcellen (ESC) zijn pluripotente cellen, afgeleid van inplanting embryo’s, die de mogelijkheid om zelf vernieuwen of onderscheid onder specifieke voorwaarden1te behouden. Op basis van deze eigenschappen, ESC geworden een nuttig hulpmiddel voor regeneratieve geneeskunde, ziekte modellering en weefsel engineering studies2.
ESC waren ontleend voor inplanting muis embryo’s, van oorsprong muis ESC (mESC) lijnen met lage succes3,4voor de eerste keer. Jarenlang bleef de efficiëntie van de afleiding laag vanwege de moeilijkheid van het handhaven van pluripotent in vitro. Naast de aanwezigheid van feeder cellen5, die de efficiëntie van de afleiding, kolonie gehechtheid bevorderen, en vergroten van de stabiliteit van de karyotypic6, verschillende wijzigingen van het protocol tot een verbetering in pluripotent onderhoud. De belangrijkste moesten de toevoeging van leukemie Inhibitory Factor (LIF) mESC kweekmedium7,8, het gebruik van embryo’s uit de 129S2 tolerante achtergrond9 en de cultuur van mESC met medium aangevuld met gedefinieerd serum, potentiële factoren van de differentiatie10gratis. Recenter, dwingend bewijs blijkt dat toevoeging van een cocktail van twee kleine-molecuul modulatoren van signaalroutes aan het mESC kweekmedium (bekend als 2i) is het beste om pluripotent. De cocktail 2i bestaat uit een combinatie van de MEK-remmer PD0325901, waardoor de differentiatie signalen door remming van het traject van mitogeen-geactiveerd proteïne kinase (MAPK), en de GSK3β-remmer CHIR99021, die overleving van de cel bij lage dichtheid verbetert door het activeren van de Wnt traject11.
In dit artikel beschrijven we een eenvoudig protocol om efficiënt ontlenen muis blastocysten mESC lijnen. We volgen standaardprocedures, kweken van embryo’s uit tolerante stammen op feeder cellen in afleiding medium aangevuld met LIF en een serum vervanging12. Na dit protocol, mESC lijnen kan worden afgeleid met efficiëntie gelijkwaardig zijn aan die verkregen in 2i medium. Desondanks kunnen 2i worden toegevoegd om te voorkomen dat eventuele problemen met pluripotent onderhoud of bij het werken met niet-tolerante stammen.
Protocol
Representative Results
Discussion
MESC lijn afleiding is een bekende procedure routinematig gebruikt in veel laboratoria, is de doeltreffendheid ervan niet altijd zo hoog zoals verwacht als gevolg van meerdere factoren die pluripotent onderhoud kan verstoren. In dit artikel tonen we stap voor stap hoe om mESC lijnen met hoge rendementen met behulp van een eenvoudige en betrouwbare protocol. Deze efficiëntie zijn vergelijkbaar met die in de literatuur gemeld.
Om ervoor te zorgen maximale efficiëntie, is het belangrijk om te c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Jonatan Lucas voor zijn technische bijstand met feeder celcultuur, à Estabulari de la UAB voor verzorging van de dieren en Domènec Martín voor het vastleggen van de video. Dit werk werd ondersteund door Ministerio de Economia y Competitividad AGL2014-52408-R en de Generalitat de Catalunya 2014 SGR-524. MVC is een begunstigde van een PIF-UAB fellowship.
Materials
| 1 mL sryringe | BD | 309628 | |
| 2-β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350-010 | |
| 4-well plate | Thermo Scientific Nunc | 176740 | |
| Acidic Tyrode's solution | Home-made | See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4ºC. Alternatively, for long-term storage keep it at -20ºC. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M. | |
| BSA | Sigma | A3311 | |
| Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Molecular Probes – Invitrogen | A-21200 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, αSMA and AFP mouse antibodies. |
| CHIR990212 | Axon Medchem | 1386 | Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
| CryoTube | Thermo Scientific Nunc | 3754518 | |
| DMSO | Sigma | 41640 | |
| DMEM | BioWest | L0107 | |
| FBS | BioWest | S1810 | Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56ºC. Aliquot and store at -20ºC |
| Flushing needle | BD | 304000 | Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone |
| Gelatin from porcine skin | Fluka | 48724 | Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month. |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594 | Molecular Probes – Invitrogen | A-11037 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody. |
| HBSS | BioWest | L0611 | |
| Hepes-buffered CZB | Home-made | See composition in Chatot et al, 1989 | |
| Human chorionic gonadotropin | Divasa-Farmavic | Veterin-Corion 3000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
| Human foreskin fibroblasts | ATCC | ATCCSCRC-1041 | For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen. |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20ºC (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles. |
| KSOMaag Evolve | Zenith Biotech | ZEKS-050 | Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37ºC and 5% CO2 a day prior to use. |
| Leukemia Inhibitory Factor | Merk Millipore | ESG1106 | |
| Mice | Charles River/Harlan | It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor. | |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | Embryo tested. Photosensitive. |
| Mitomycin C | Serva | 2980501 | Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4ºC protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer. |
| Mouse anti-tubulin β III (Tuj1) | Biolegend | MMS-435P | 1:500 dilution |
| Mouse monoclonal anti-αSMA | Sigma | A5228 | 1:200 dilution |
| Mouse monoclonal anti-AFP | R&D Systems | MAB1368 | 1:50 dilution |
| Mouse monoclonal anti Oct3/4 | Santa cruz | Sc-5279 | 1:50 dilution |
| Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-035 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | 1408 | Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
| Petri dish (35mm) | Thermo Scientific Nunc | 153066 | |
| Petri dish (60mm) | Thermo Scientific Nunc | 150288 | |
| Pregnant mare's serum gonadotropin | Foligon | Foligon-1000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
| Rabbit policlonal anti-Sox2 | Merck Millipore | AB5603 | 1:200 dilution |
| T75 falcon | Thermo Scientific | 130190 | |
| Trypsin-EDTA 10x | BioWest | X0930 | Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution |
References
- Biswas, A., Hutchins, R. Embryonic stem cells. Stem Cell Dev. 16 (2), 213-221 (2007).
- Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. PNAS. 72 (4), 1441-1445 (1976).
- Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nat Prot. 9 (3), 559-574 (2014).
- Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336 (6200), 688-690 (1988).
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
- Brook, F. A., Gardner, R. L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. Proc Nat Acad Sci U S A. 94 (11), 5709-5712 (1997).
- Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer. Lab Invest. 82 (12), 1765-1767 (2002).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Wakayama, S., et al. Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies. Stem cells (Dayton, Ohio). 25 (4), 986-993 (2007).
- Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).
- Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. . Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2003).
- Lee, K. H. Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture. Pluripotent Stem Cells. , 85-115 (2013).
- Ma, Y., et al. Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Res Ther. 3 (29), (2012).
- Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39 (2), 100-104 (2004).
- Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells. Cytotechnology. 58 (3), 173-179 (2008).
- Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines. Int. J. Dev. Biol. 38 (2), 385-390 (1994).
- Gonzalez, J. M., et al. Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency. Stem Cell Rep. 7 (2), 177-191 (2016).
