Chirurgia piezoelettrica ha portato a miglioramenti in chirurgia maxillo-facciale e dentale umano. Abbiamo sviluppato un protocollo per ottimizzare la chirurgia piezoelettrica per chirurgia cranica finestra nei topi.
La microscopia multifotonica è stato ampiamente adattata per l’imaging di neuroni in vivo. Formazione immagine ripetuta richiede l’impianto di una finestra cranica o ripetute assottigliamento del cranio. Chirurgia cranica finestra viene in genere eseguita con un trapano rotante ad alta velocità, e molti ricercatori trovano stimolante per impedire che il trapano danneggiare il delicato dura e vasi sanguigni. Vasto e la pratica è necessaria per rimuovere l’osso senza danneggiare i tessuti sottostanti e quindi chirurgia cranica finestra può essere difficile, che richiede tempo e produrre danni ai tessuti. La chirurgia piezoelettrica, che viene ampiamente utilizzata per la chirurgia maxillo-facciale e dentale, utilizza le vibrazioni ad ultrasuoni per rimuovere l’osso senza danneggiare i tessuti molli. Abbiamo sviluppato un metodo applicando la chirurgia piezoelettrica per migliorare la chirurgia cranica finestra nei topi in preparazione per l’imaging multiphoton. Confronti all’interno del nostro laboratorio di trovano che il metodo richiede meno tempo di chirurgia e ha un tasso medio più basso delle complicazioni dovuto spurgo dural rispetto alla chirurgia cranica finestra con un trapano rotativo.
Chirurgia cranica finestra per prepararsi roditori multifotonica imaging in vivo è diventata un’importante tecnica nell’ambito delle neuroscienze. La rimozione o l’assottigliamento dell’osso è necessario preparare il mouse per imaging ottico con un microscopio multifotonica. Questa chirurgia è eseguita rimuovendo completamente un’area dell’osso per esporre la sottostante dura1o fluidificando una regione dell’osso senza rimozione completa dalla dura2. L’approccio di cranio sottile può produrre meno infiammazione e attivazione della microglia3 ma fornisce una profondità minore di imaging, una dimensione di finestra di imaging più piccola (200 µm) e un periodo di tempo limitato durante il quale la finestra può essere imaged a causa di ricrescita ossea2 . L’aggiunta di una finestra di vetro lucido e rinforzato (porte) può aumentare le dimensioni imaging e il periodo di formazione immagine, ma è difficile da eseguire4.
Entrambi gli interventi attuali utilizzano un trapano rotativo ad alta velocità per sottile o rimuovere l’osso dal cranio. La tecnica di cranio sottile utilizza anche un bisturi dopo il trapano per fluidificare ulteriormente l’osso2. La tecnica di porte richiede il passaggio aggiuntivo di alta velocità di lucidatura con grana4. In un’alta velocità trapano rotativo, un’aria alimentata turbina o motore elettrico fa sì che la punta del trapano a girare ad alta velocità. Come Trapani rotativi sezione sia dell’osso che dei tessuti molli, esiste un rischio di danneggiare la dura madre e dei vasi sanguigni di fondo. Il successo della chirurgia dipende dalla abilità del chirurgo. Oltre a queste finestre preparate con metodi chirurgici meccanici, un metodo chimico di otticamente il cranio con diverse soluzioni di compensazione è stato sviluppato5,6. Tuttavia, poiché la chirurgia piezoelettrica è un metodo meccanico di chirurgia, nostri confronti qui sarà limitati ad altri metodi meccanici.
Dispositivi chirurgici piezoelettrici utilizzano vibrazioni ultrasoniche per abbattere osso mineralizzato senza danneggiare tessuti molli sottostanti e quindi offrono un approccio per sottile rapidamente una vasta area dell’osso. In un manipolo chirurgico piezoelettrico, la turbina è sostituita da una pila di dischi ceramici e quando viene applicata la corrente, i dischi vibrano a frequenze ultrasoniche. Le vibrazioni vengono trasferite attraverso il manipolo a diamante rivestiti suggerimenti per tagliare attraverso l’osso senza danneggiare tessuti molli, un vantaggio su Trapani rotativi che non discriminano tra i tipi di tessuto. La chirurgia piezoelettrica è stato originariamente sviluppata per l’uso nell’uomo di Tomaso Vercellotti e ha portato a miglioramenti nel dentale e cranio-maxilofacial chirurgia7,8,9,10,11 .
La chirurgia piezoelettrica è stata utilizzata per creare un’osteotomia in ratti Wistar e fu trovata da formazione immagine a risonanza magnetica (MRI) e l’istologia per produrre molti meno danni rispetto a un tradizionale trapano odontoiatrico12. Gli autori hanno concluso che la chirurgia piezoelettrica era sicura per la rimozione dell’osso vicino tessuto cerebrale morbido. Mouse, tuttavia, hanno una dura più sottile che è danneggiato più facilmente, e che lo studio non si prepara windows per imaging ottico cronica. Formazione immagine cronica richiede che i vasi sanguigni non siano danneggiati e che non formano coaguli di sangue sotto la finestra. Danni al dura conducono ad infiammazione che causa la finestra verso il cloud, e attiva le microglia e la proliferazione di astrociti reattivi. Qui abbiamo ottimizzato la chirurgia piezoelettrica per topi creare sia sottile teschio e ossa completo cranica windows rimozione adatto per l’imaging cronica. Abbiamo confrontato questa tecnica chirurgica agli ambulatori cranica finestra preparato con un trapano rotante ad alta velocità.
La chirurgia può essere modificata cambiando la punta chirurgica. Ci sono molti formati differenti della punta che possono essere applicati al manipolo. Modificare le dimensioni o la forma della punta si tradurrà in finestre di dimensioni diverse. Oltre la punta di 4 mm, abbiamo anche provato una punta di 3 mm e trovato che ha anche funzionato bene. Anche con irrigazione con ghiaccio freddo ACSF, non eravamo in grado di ottenere buoni risultati con le punte che erano troppo strette (circa 0,25 mm) a causa di vibrazioni concentrate causando troppo calore e bruciare l’osso conseguenti danni al sottostante dura. Non abbiamo provato la moltitudine di altri suggerimenti che sono disponibili, e ci aspettiamo che altri laboratori possono trovare nuove applicazioni per questi consigli diversi. Mentre la chirurgia è relativamente semplice, abbiamo trovato che ci sono diversi passaggi che potrebbero richiedere la risoluzione dei problemi. Il primo è che la punta vibra produce un sacco di turbolenza in ACSF, che diminuisce la visibilità e produce difficoltà nell’accertare la profondità dell’osso dell’osso assottigliamento passo della chirurgia. È consigliabile che se è troppo difficile vedere quanto l’osso è sottile, prenditi una pausa per asciugare il cranio e la finestra applicando un tampone di cotone sterile al lato dell’osso. Non applicare il tampone di cotone direttamente alla finestra, dal momento che la superficie ruvida è dannoso per osso sottile. Dopo aver controllato la profondità, è necessario riapplicare ACSF e continuare con la chirurgia. Abbiamo anche trovato che se c’è danno al dura, è solitamente dovuto il chirurgo mettere troppa pressione sulla punta. Tenendo il manipolo più delicatamente e applicare meno forza probabilmente risolverà questo problema. Se il chirurgo è forzatamente raschiando la punta sull’osso, esso causerà una pausa nell’osso sottile e danneggiare il cranio. Infine, se dopo aver assottigliamento dell’osso, il sottostante dura contuso, è probabilmente dovuto il calore in eccesso dalle vibrazioni. Aumento del tasso di flusso ACSF risolverà questo problema.
La limitazione principale di FASORE è che il manipolo può sottile dell’osso, ma non è possibile rimuovere tutte le ossa sopra la dura madre. La punta rivestita di diamante ha piccoli urti ruvide. Lo sfregamento serviva per fluidificare il cranio sarebbe carteggiare la dura madre e causare sanguinamento se esso venisse utilizzato per rimuovere tutte le ossa. Così, per rimuovere lo strato sottile restante è necessaria l’applicazione del forcipe. Mentre ci è dibattito continuo su se la formazione immagine attraverso un cranio sottile produce meno proliferazione di microglia e astrociti reattivi e meno infiammazione, in alcuni casi una finestra con nessun osso restante è preferita, ad esempio, per fornire una maggiore profondità di imaging3 .
Abbiamo ottimizzato la preparazione di finestra cranica per multiphoton imaging in topi. FASORE è, a nostra conoscenza, la prima applicazione della tecnica piezoelettrica per chirurgia cranica roditore finestra per imaging ottico. Troviamo che l’uso della chirurgia piezoelettrica in topi condivide i vantaggi di velocità aumentata e diminuita eventi avversi segnalati anche in esseri umani7,8,9,10. L’utilizzo del dispositivo piezoelettrico è provocato da interventi chirurgici più veloce (Figura 2A) e meno eventi avversi di sanguinamento rispetto ad una rotativa ad alta velocità trapano (Figura 2B). Abbiamo anche trovato, all’interno del nostro laboratorio, che FASORE era più facile per i chirurghi di nuovi da imparare rispetto agli approcci tradizionali alla chirurgia cranica finestra. Vantaggi di velocità e facilità d’uso sono probabilmente diverse fra i chirurghi. Preparazioni di cranio sottili richiedono in genere 30-45 min per fluidificare l’osso con un trapano e bisturi2, mentre l’approccio FASORE richiede in genere meno di 10 min.
Abbiamo trovato che in windows preparata con FASORE potremmo immagine transitori di calcio nei neuroni piramidali di livello 4 nella corteccia di motore che era stato transfected con virus adeno associato codifica l’indicatore di calcio JRGECO1a (AAV9. Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40). Inoltre abbiamo trovato che, rispetto a una finestra cranica cranio sottile preparata con un trapano rotativo e bisturi, l’imaging regione era più grande, mentre un cranio sottile preparato con un trapano rotativo e bisturi ha una finestra di imaging 20 µm di diametro2 . Con FASORE, siamo stati in grado di sottile rapidamente un’area di 3-4 mm. Questo è simile alla finestra di imaging segnalata con porte4. Questa finestra più grande conserva il vantaggio della rappresentazione rapida segnalato per windows cranio sottile preparata con un trapano odontoiatrico e bisturi. Inoltre, la finestra preparata con FASORE può essere imaged immediatamente, al contrario di rimozione dell’osso tradizionale windows che può richiedere settimane per guarire prima che la finestra può essere ottimamente ripreso3.
Questa tecnica può essere applicata per lo studio delle alterazioni del flusso sanguigno nei vasi sotto la dura madre. Un importante studio futuro è quello di confrontare il immunoreactivity di FASORE con altri metodi di finestra cranica. Questo sarebbe importante per determinare se il FASORE produce meno infiammazione rispetto a metodi esistenti. Ci auguriamo che la tecnica chirurgica piezoelettrica documentata qui permetterà altri labs eseguire windows cranica e utilizzare correttamente multifotonica imaging in vivo.
Assicurarsi che il manipolo è impostato a vibrare l’impostazione più bassa e che il ACSF è essere irrigato a una velocità costante. Il freddo di ghiaccio che ACSF deve essere applicato costantemente o si sarà riscaldare e danneggiare la dura madre. Abbiamo trovato che ACSF deve essere applicato a una velocità di almeno 1 mL/min. utilizzare una siringa tenuto in mano, o utilizzare una pompa peristaltica, piuttosto che l’irrigazione integrato nel manipolo. Il sistema di irrigazione nel manipolo espelle ACSF con troppa forza e produce troppa turbolenza, che significativamente alterare la visibilità.
The authors have nothing to disclose.
Tamara Zeric per aver contribuito a ottenere l’immagine multifotonica in questa carta. Supportato da cervello & comportamento, morbo di Parkinson e JPB fondazioni, MH108186 R01 e DA07418 R01. F31 fellowship 1F31MH109293-01A1 a C. S
Piezosurgery Touch | Mectron | 5120062 | Piezosurgery GP model has the same settings |
Circular 4mm flat piezosurgery tip (# OT11) | Mectron | 3370019 | This tip was ideal for our windows but there are many other tips of different sizes availible. |
Stereotax frame | Kopf | 963 | |
Mouse adaptor | Stoelting | 51625 | |
Peristaltic pump for irrigation. | Cole-Parmer | WU-77120-42 | Makes it easier to irrigate and frees up the other hand to provide stability. Irrigation can be performed by hand with a syringe if necessary. |
Avitene Ultrafoam | Bard-Davol | 1050020 | Important to stop any minor bleeding instantly. |
C&B Metabond | Parkell | S380 | Much stronger than regular dental acrylic. |
Artificial cerebro spinal fluid (ACSF) | Tocris | 3525 | |
Puralube opthalmic ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
Mice | JAX | 664 | |
Prairie Ultima multiphoton microscope | Olympus | ||
JRGECO1a (AAV9.Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40) | UPENN Vector Core |