Flow flowcytometri-baserede stof Screening System til identifikation af små molekyler, der fremmer Celledifferentiering glioblastom stamceller
Summary
En effektiv screening protokol præsenteres til identifikation af små molekyler, der fremmer astroglial differentiering i glioblastom stamceller (GSCs). Analysen er baseret på en stamcelle differentiering reporter hvorved udtryk for forbedrede normal god landbrugspraksis (eGFP) er drevet af den menneskelige GFAP promotor.
Abstract
Glioblastom (GBM) er den mest almindelige og mest dødbringende primær hjernetumor i voksne, forårsager omkring 14.000 dødsfald hvert år i USA alene. Median overlevelse efter diagnosen er mindre end 15 måneder med maksimal kirurgisk resektion, stråling og temozolomide kemoterapi. Udfordringer forbundet med at udvikle mere effektive GBM behandlinger er blevet stadig mere klart, og omfatter sin ubøjelige invasionsevne, dens modstand til standard behandlinger, dens genetiske kompleksitet og molekylære tilpasningsevne og delpopulationer af GBM celler med fænotypisk ligheder med normal stamceller, herefter omtalt som glioblastom stamceller (GSCs). Fordi GSCs er nødvendige for tumorvækst og progression, repræsenterer differentiering-baseret terapi en levedygtig behandling modalitet for disse uhelbredelig neoplasmer.
Følgende protokol beskriver en samling af procedurer til at etablere en high throughput screening platform med henblik på identifikation af små molekyler, der fremmer GSR astroglial differentiering. Kernen i systemet er en glial fibrillære sure protein (GFAP) differentiering reporter-konstruktion. Protokollen indeholder følgende generelle procedurer: (1) oprettelse af GSR differentiering reporter linjer; (2) test/validering reporter relevans for GSR self-fornyelse/clonogenic kapacitet; og (3) høj kapacitet flowcytometri baseret stof screening.
Screening platform giver en enkel og billig metode til at identificere små molekyler, der fremmer GSCs differentiering. Derudover rummer udnyttelse af biblioteker af FDA-godkendt medicin potentiale til identificering af agenser, der kan repurposed hurtigere. Også forventes terapier, der fremmer kræft stamceller differentiering at arbejde synergistisk med nuværende “standard of care” behandlingsformer, der har vist sig at målrette og fjerne primært mere differentierede kræftceller.
Introduction
Nylige undersøgelser har vist, at tumorer indeholder en lille population af celler, betegnes kræftstamceller (CSCs) eller tumor-indlede celler, som er ansvarlig for tumor progression, metastaser og modstand mod kemo – og radio-terapier 1, 2. tilstedeværelsen af kræftstamceller og deres mere differentieret descendenter inden for tumorer betragtes som en vigtig faktor at fremme intratumoral heterogenitet og udgør således en stor forhindring i behandling af kræft3. Tumor celle hierarki, leveret af kræft stamceller teori, har inspireret udviklingen af nye strategier til at behandle kræft 4. En metode for målretning af kræftstamceller er at identificere og hæmmer signaling veje, der er kendt for at være nødvendige under fosterudviklingen af det berørte organ. Faktisk, vi og andre har tidligere offentliggjort flere artikler beskriver den løbende krav om de stamcelle-relevante signaling nervebaner Sonic Hedgehog og hak i glioblastom5,6,7. Dette arbejde har hjulpet i solidifying begrundelsen for flere GBM kliniske forsøg. En anden tilgang til at målrette kræftstamceller er at fremme deres differentiering. Denne tilgang har modtaget megen støtte på grund af de gunstige resultater af prækliniske og kliniske undersøgelser i behandling af akut promyelocyt leukæmi med retinoid syre (ATRA, et vitamin-A analog). Her fandtes ATRA at fjerne modning blok og fremme kræft celle differentiering8. Mere nylig, Piccirillo og kolleger har elegant vist at BMP-4 fremmer GSR differentiering i astrocytter med betydelig anti-GBM virkninger i in vitro og i vivo9.
Begrundelsen for den nuværende undersøgelse er baseret på en “omvendt engineering” tilgang til at målrette GSCs. I betragtning af den enorme heterogenitet stede i GBM og med dårlig differentiering er et af kendetegnene ved kræft, spurgte vi hvis vi kunne fremme en mere gunstig fænotype – differentiering i en astrocyte-lignende tilstand. Vi har her, ikke forudgående kendskab til signalering veje at opretholde GSCs i en given tumor modellen men snarere har til formål at opnå en ønsket fænotype (fx GFAP positivitet).
Denne rapport beskriver de procedurer, der anvendes til at etablere GSR differentiering reporter-linjer fra transduktion af GSR-beriget kulturer til GSR klonavl. Glioblastom neurosphere linjer bruges blev etableret i laboratoriet af Professor Angelo Vescovi fra patienter med en diagnose af primær glioblastom på hospitalet San Raffaele – Milano, Italien. Disse linjer er blevet grundigt undersøgt i flere publikationer 6,10,11,12,13,14. Det anbefales, at personer, der er interesseret i at gennemføre disse teknikker i deres laboratorium afgøre relevansen af reporter at kræft stamceller selvfornyelse kapacitet i de celler, de planlægger at studere (dette er sandt for enhver journalist). En detaljeret protokol for en af de in vitro- clonogenic assays accepteret i feltet er fastsat til at udføre denne15,16. Endelig, en detaljeret protokol beskriver udnyttelse af differentiering reporter-linjer i et flowcytometri baseret stof skærmen er leveret i slutningen. Af note, ligeledes astroglial differentiering systemet beskrevet her, har vi med succes etableret og godkendt GSR reporter linjer integrere en MAP2:GFP (neuronal differentiering) reporter. Derfor, metoderne, der beskrives i dette papir kan anvendes til at studere Celledifferentiering i forskellige celle lineages.
Nogle af tallene i denne rapport kan findes i en nylig publikation: “Atracurium Besylate og andre neuromuskulære blokerende agenter fremme astroglial differentiering og nedbryder glioblastom stamceller18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mens de fleste af de tidligere undersøgelser af GSCs fokuseret primært på markører, der definerer dem, i denne undersøgelse besluttede vi at tage den omvendte fremgangsmåde. Vi fokuserer primært på de differentierede descendenter genereret af GSCs (fx celler udtrykker astroglial og neuronal markører). Her viser vi udnyttelse af en celle-baserede høj overførselshastighed stof screening system, der er baseret på menneskelige GFAP promotor-afhængige udtryk for normal god landbrugspraksis. Alle eksperimenterne b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er blevet delvist understøttet af NIH R01CA187780.
Materials
| ESGRO Complete Accutase | EMD Millipore | SF006 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus) | SBI (System Biosciences) | SR10015VA-1 | |
| 50 ml sterile disposable reagent reservoirs | Corning | 4870 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 96 well plate | Falcon | 353072 | |
| Biolite T25 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biolite T75 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130190 | |
| 15 ml Centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 1.5ml Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 – 20uL | VistaLab Technologies | 1060-0020 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL | VistaLab Technologies | 1060-0250 | |
| Multi 12-channel pipette tips 25 μl | VistaLab Technologies | 4060-1002 | |
| Multi 12-channel pipette tips 250 μl | VistaLab Technologies | 4060-9025 | |
| Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer | EMD Millipore | 0500-4005 | |
| NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries | Evotec | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For the preparation of neural stem cell media (500 mL) | Final concentration | ||
| BSA | GoldBio.com | A-421-250 | 0.20% |
| DMEM/F12 10X | Corning | 90-091-PB | 1X |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3149 | 0.0002% |
| HEPES 1M | Sigma Aldrich | H4036 | 5.4 mM |
| Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X) | Life Technologies | 41400-045 | 1X |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | 14.5 mM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X | Gibco | 15140-122 | 1X |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | 16 nM |
| Putrescine | Sigma Aldrich | P5780 | 4.8 µM |
| Basic FGF (FGF2), Human | GoldBio | 1140-02-50 | 10 ng/ml |
| EGF, Human | GoldBio | 1150-04-100 | 20 ng/ml |
| Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind | Corning | 431160 | Use to filter sterlize media |
References
- Maher, E. A., et al. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15 (11), 1311-1333 (2001).
- Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Heterogeneity maintenance in glioblastoma: a social network. Cancer Res. 71 (12), 4055-4060 (2011).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Sul, J., Fine, H. A. Malignant gliomas: new translational therapies. Mt Sinai J Med. 77 (6), 655-666 (2010).
- Bar, E. E., Chaudhry, A., Farah, M. H., Eberhart, C. G. Hedgehog signaling promotes medulloblastoma survival via Bc/II. Am J Pathol. 170 (1), 347-355 (2007).
- Chu, Q., Orr, B. A., Semenkow, S., Bar, E. E., Eberhart, C. G. Prolonged inhibition of glioblastoma xenograft initiation and clonogenic growth following in vivo Notch blockade. Clin Cancer Res. 19 (12), 3224-3233 (2013).
- Schreck, K. C., et al. The Notch target Hes1 directly modulates Gli1 expression and Hedgehog signaling: a potential mechanism of therapeutic resistance. Clin Cancer Res. 16 (24), 6060-6070 (2010).
- Warrell, R. P., et al. Differentiation therapy of acute promyelocytic leukemia with tretinoin (all-trans-retinoic acid). N Engl J Med. 324 (20), 1385-1393 (1991).
- Piccirillo, S. G., et al. Bone morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature. 444 (7120), 761-765 (2006).
- Bar, E. E., et al. Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma. Stem Cells. 25 (10), 2524-2533 (2007).
- Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres. Am J Pathol. 177 (3), 1491-1502 (2010).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathol. 50 (4), 357-368 (2012).
- Lim, K. S., et al. Inhibition of monocarboxylate transporter-4 depletes stem-like glioblastoma cells and inhibits HIF transcriptional response in a lactate-independent manner. Oncogene. 33 (35), 4433-4441 (2014).
- Kahlert, U. D., et al. ZEB1 Promotes Invasion in Human Fetal Neural Stem Cells and Hypoxic Glioma Neurospheres. Brain Pathol. 25 (6), 724-732 (2014).
- Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. J Immunol Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).
- Meyer, M., et al. Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 851-856 (2015).
- Galli, R., et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64 (19), 7011-7021 (2004).
- Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. Atracurium Besylate and other neuromuscular blocking agents promote astroglial differentiation and deplete glioblastoma stem cells. Oncotarget. 7 (1), 459-472 (2016).
