Stroom Cytometry gebaseerde Drug Screening systeem voor de identificatie van kleine moleculen die bevordering van celdifferentiatie van Glioblastoma stamcellen
Summary
Een efficiënte screening-protocol wordt gepresenteerd voor de identificatie van kleine moleculen ter bevordering van astroglial differentiatie in glioblastoma stamcellen (GSCs). De bepaling is gebaseerd op een stamcel differentiatie verslaggever waarbij de expressie van de verbeterde GFP (eGFP) wordt gedreven door de menselijke promotor van het algemeen kaderakkoord voor vrede.
Abstract
Glioblastoma (GBM) is de meest voorkomende en meest dodelijke primaire hersentumor bij volwassenen, waardoor ongeveer 14.000 doden elk jaar in de VS alleen. Mediane overleving na diagnose is minder dan 15 maanden met maximale chirurgische resectie, straling en temozolomide chemotherapie. De uitdagingen die inherent zijn aan de ontwikkeling van effectievere behandelingen GBM steeds duidelijk geworden, en omvatten de onverzettelijke invasiviteit, haar weerstand tegen standaard behandelingen zijn genetische complexiteit en moleculaire aanpassingsvermogen en subpopulaties van GBM cellen met fenotypische overeenkomsten met normale cellen van de stam, hierna te noemen glioblastoma stamcellen (GSCs). Omdat GSCs vereist voor tumorgroei en progressie zijn, vertegenwoordigt differentiatie gebaseerde therapie een levensvatbare behandeling modaliteit voor deze ongeneeslijke gezwellen.
Het volgende protocol beschrijft een verzameling van procedures om een hoge throughput screening platform gericht op de identificatie van kleine moleculen ter bevordering van de GSC astroglial differentiatie. De kern van het systeem is een gliale fibrillary zuur eiwit (GFAP) differentiatie verslaggever-construct. Het protocol bevat de volgende algemene procedures: (1) tot oprichting van de GSC differentiatie verslaggever lijnen; (2) testen/valideren de relevantie van de verslaggever voor GSC zelf-vernieuwing/clonogenic capaciteit; en (3) hoge capaciteit stroom-cytometry gebaseerd drug screening.
De screening-platform biedt een eenvoudige en goedkope aanpak ter identificatie van de kleine moleculen ter bevordering van de differentiatie van de GSCs. Gebruik van bibliotheken van FDA-goedgekeurde geneesmiddelen houdt bovendien de mogelijkheden voor de identificatie van agenten die sneller andere doelen kan worden gebruikt. Ook worden therapieën die bevordering van Kanker stamcel differentiatie geacht te werken synergetisch met huidige “standaard van zorg” therapieën die te richten en te elimineren vooral meer gedifferentieerde kankercellen is gebleken.
Introduction
Recente studies hebben aangetoond dat tumoren een kleine populatie bevatten van cellen, cellen van de stam van kanker (CSCs) of inleiding van de tumor cellen, genoemd die belast zijn met progressie van de tumor, uitzaaiingen en weerstand tegen chemo – en radio-therapieën 1, 2. de aanwezigheid van cellen van de stam van kanker en hun meer gedifferentieerde nakomelingschap binnen tumoren wordt beschouwd als een belangrijke factor die bevordering van intratumoral heterogeniteit en vormt aldus een grote hindernis in het behandelen van kankers3. Tumor cel hiërarchie, geboden door de theorie van de stamcel kanker, heeft de ontwikkeling van nieuwe strategieën voor de behandeling van kankers 4geïnspireerd. Een aanpak voor het richten van de cellen van de stam van kanker is het identificeren en remmen signaalroutes waarvan bekend is dat tijdens de embryonale ontwikkeling van het betrokken orgaan verplicht worden. Inderdaad, wij en anderen eerder hebben gepubliceerd meerdere documenten beschrijven de voortdurende eis van de neurale stamcellen-relevante signaalroutes Sonic Hedgehog en Notch in glioblastoma5,6,7. Dit werk heeft geholpen bij het stollen van de motivering van de verschillende GBM klinische proeven. Een tweede aanpak voor het richten van de cellen van de stam van kanker is het bevorderen van hun differentiatie. Deze aanpak heeft ontvangen veel steun als gevolg van de gunstige resultaten van preklinische en klinische studies in het behandelen van acute promyelocytic leukemie met retinoic zuren (ATRA, een vitamine-A-analoog). Hier bleek ATRA te verwijderen van het blok van rijping en kanker cel differentiatie8te bevorderen. Meer recent, Piccirillo en collega’s elegant is gebleken dat BMP-4 GSC differentiatie in astrocyten met belangrijke anti-GBM effecten in vitro en in vivo9 bevordert.
De reden voor de huidige studie is gebaseerd op een “omgekeerde engineering” aanpak voor het richten van de GSCs. Gezien de grote heterogeniteit aanwezig in GBM en met arme differentiatie wordt een van de kenmerken van de kanker, vroegen we als we een meer gunstige fenotype – differentiatie in een Astrocyt-achtige toestand kunnen bevorderen. Wij hebben hier geen voorkennis van de signaalroutes die handhaven GSCs een gegeven tumor specimen maar veeleer streven naar een gewenste fenotype (bijvoorbeeld GFAP positiviteit).
Dit verslag beschrijft de procedures die zijn gebruikt om de GSC differentiatie verslaggever-lijnen van de transductie van GSC-verrijkt culturen aan GSC kloonselectie. Het glioblastoma neurosphere lijnen gebruikt werden opgericht aan het laboratorium van Professor Angelo Vescovi van patiënten met een diagnose van primaire glioblastoma bij ziekenhuis San Raffaele – Milano, Italië. Deze lijnen zijn uitvoerig bestudeerd in verschillende publicaties 6,10,11,12,13,14. Het is sterk aanbevolen dat personen die geïnteresseerd zijn in het implementeren van deze technieken in hun laboratorium bepalen de relevantie van de verslaggever voor Kanker stamcel zelf-vernieuwing capaciteit in de cellen die zij van plan om te studeren (dit geldt voor elke verslaggever). Een gedetailleerd protocol voor één van de in vitro clonogenic tests geaccepteerd in het veld wordt geleverd aan het bereiken van deze15,16. Ten slotte, een gedetailleerd protocol met een beschrijving van het gebruik van de differentiatie verslaggever-lijnen in een flow-cytometry gebaseerd drug scherm wordt geleverd aan het eind. Van de nota, hebben ook aan het astroglial differentiatie systeem hier beschreven, we met succes vastgesteld en gevalideerd GSC verslaggever lijnen integratie van een MAP2:GFP (neuronale differentiatie) verslaggever. Daarom de methoden beschrijven in dit papier kan worden toegepast om te bestuderen van celdifferentiatie in verschillende geslachten van de cel.
Enkele van de cijfers in dit verslag kan worden gevonden in een recente publicatie: “Atracurium Besylate en andere neuromusculaire blokkering agenten bevorderen astroglial differentiatie en afbreken van glioblastoma stamcellen18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Terwijl de meeste van de eerdere studies van GSCs was vooral gericht op de markeringen die ze bepalen, in dit onderzoek besloten hebben we om de omgekeerde aanpak. We concentreren ons vooral op de gedifferentieerde nakomelingschap gegenereerd door GSCs (bijvoorbeeld cellen uiten van astroglial en neuronale stiften). Hier tonen we het gebruik van een hoge-doorvoer-cel-gebaseerde drug screening systeem, dat gebaseerd is op menselijke GFAP promotor-afhankelijke expressie van GFP. Alle experimenten werden uitgevoerd met behu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de NIH R01CA187780.
Materials
| ESGRO Complete Accutase | EMD Millipore | SF006 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus) | SBI (System Biosciences) | SR10015VA-1 | |
| 50 ml sterile disposable reagent reservoirs | Corning | 4870 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 96 well plate | Falcon | 353072 | |
| Biolite T25 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biolite T75 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130190 | |
| 15 ml Centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 1.5ml Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 – 20uL | VistaLab Technologies | 1060-0020 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL | VistaLab Technologies | 1060-0250 | |
| Multi 12-channel pipette tips 25 μl | VistaLab Technologies | 4060-1002 | |
| Multi 12-channel pipette tips 250 μl | VistaLab Technologies | 4060-9025 | |
| Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer | EMD Millipore | 0500-4005 | |
| NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries | Evotec | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For the preparation of neural stem cell media (500 mL) | Final concentration | ||
| BSA | GoldBio.com | A-421-250 | 0.20% |
| DMEM/F12 10X | Corning | 90-091-PB | 1X |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3149 | 0.0002% |
| HEPES 1M | Sigma Aldrich | H4036 | 5.4 mM |
| Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X) | Life Technologies | 41400-045 | 1X |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | 14.5 mM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X | Gibco | 15140-122 | 1X |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | 16 nM |
| Putrescine | Sigma Aldrich | P5780 | 4.8 µM |
| Basic FGF (FGF2), Human | GoldBio | 1140-02-50 | 10 ng/ml |
| EGF, Human | GoldBio | 1150-04-100 | 20 ng/ml |
| Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind | Corning | 431160 | Use to filter sterlize media |
References
- Maher, E. A., et al. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15 (11), 1311-1333 (2001).
- Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Heterogeneity maintenance in glioblastoma: a social network. Cancer Res. 71 (12), 4055-4060 (2011).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Sul, J., Fine, H. A. Malignant gliomas: new translational therapies. Mt Sinai J Med. 77 (6), 655-666 (2010).
- Bar, E. E., Chaudhry, A., Farah, M. H., Eberhart, C. G. Hedgehog signaling promotes medulloblastoma survival via Bc/II. Am J Pathol. 170 (1), 347-355 (2007).
- Chu, Q., Orr, B. A., Semenkow, S., Bar, E. E., Eberhart, C. G. Prolonged inhibition of glioblastoma xenograft initiation and clonogenic growth following in vivo Notch blockade. Clin Cancer Res. 19 (12), 3224-3233 (2013).
- Schreck, K. C., et al. The Notch target Hes1 directly modulates Gli1 expression and Hedgehog signaling: a potential mechanism of therapeutic resistance. Clin Cancer Res. 16 (24), 6060-6070 (2010).
- Warrell, R. P., et al. Differentiation therapy of acute promyelocytic leukemia with tretinoin (all-trans-retinoic acid). N Engl J Med. 324 (20), 1385-1393 (1991).
- Piccirillo, S. G., et al. Bone morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature. 444 (7120), 761-765 (2006).
- Bar, E. E., et al. Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma. Stem Cells. 25 (10), 2524-2533 (2007).
- Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres. Am J Pathol. 177 (3), 1491-1502 (2010).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathol. 50 (4), 357-368 (2012).
- Lim, K. S., et al. Inhibition of monocarboxylate transporter-4 depletes stem-like glioblastoma cells and inhibits HIF transcriptional response in a lactate-independent manner. Oncogene. 33 (35), 4433-4441 (2014).
- Kahlert, U. D., et al. ZEB1 Promotes Invasion in Human Fetal Neural Stem Cells and Hypoxic Glioma Neurospheres. Brain Pathol. 25 (6), 724-732 (2014).
- Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. J Immunol Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).
- Meyer, M., et al. Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 851-856 (2015).
- Galli, R., et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64 (19), 7011-7021 (2004).
- Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. Atracurium Besylate and other neuromuscular blocking agents promote astroglial differentiation and deplete glioblastoma stem cells. Oncotarget. 7 (1), 459-472 (2016).
