Aplicación de la técnica de FlpOut MultiColor para estudiar morfología unicelular de alta resolución y las interacciones de la célula de Glia en Drosophila
Summary
Células de mostrar diferentes morfologías y establecen una variedad de interacciones con sus vecinos. Este protocolo describe cómo revelar la morfología de las células y para investigar la interacción célula-célula mediante el bien establecido sistema de expresión de Gal4/UAS.
Abstract
Las células muestran morfologías diferentes y complejas relaciones anatómicas. ¿Cómo las células interactúan con sus vecinos? ¿Las interacciones difieren entre los tipos de la célula o incluso dentro de un tipo determinado? ¿Qué tipo de reglas espaciales siguen? Las respuestas a tales preguntas fundamentales en vivo se han visto obstaculizadas hasta ahora por la falta de herramientas para el etiquetado de celda única de alta resolución. Aquí, se proporciona un protocolo detallado para apuntar las células con una técnica de FlpOut (MCFO MultiColor). Este método se basa en tres diferente etiquetados Reporteros (HA, bandera y V5) bajo control de la UAS que se guardan silenciosos por un terminador transcripcional flanqueado por dos sitios de la FRT (FRT-parada-FRT). Un pulso de choque de calor induce la expresión de un calor inducida por choque Flp recombinase, que elimina al azar los cassettes FRT-parada-FRT en celdas individuales: expresión ocurre solamente en células que expresan también un conductor de GAL4. Esto conduce a una matriz de células diferentemente coloreadas de un tipo celular dado que permite la visualización de la morfología de la célula individual en alta resolución. Por ejemplo, la técnica MCFO puede combinarse con controladores específicos de GAL4 gliales para visualizar la morfología de los diferentes subtipos gliales en el cerebro adulto de Drosophila .
Introduction
Glia, la población de células no neuronales del sistema nervioso (NS), se ha creído durante mucho tiempo para proporcionar un marco estático para las neuronas y por lo tanto no fueron estudiados en detalle. Sin embargo, en los seres humanos, glía constituyen la gran mayoría de las células en el NS (~ 90%) y caída en varias categorías diferentes, incluyendo astrocitos, oligodendrocitos, microglía y células de Schwann. En Drosophila, glía constituyen cerca del 10% de las células en el NS. Curiosamente, sus morfologías y funciones son notablemente similares a las que se encuentran en vertebrados1,2. Sus morfologías incluyen barrera blood – brain (BBB) formación de epitelios, envolvente y astrositos-como las células.
El sistema de nervioso central de Drosophila (CNS) consta de las siguientes estructuras principales: regiones de la corteza que contienen los cuerpos celulares neuronales; neuropils que albergan conexiones sinápticas; tractos de axones pequeños y grandes que conectan diferentes neuropiles; nervios periféricos que conectan músculos y órganos sensoriales con el SNC (figura 1). Glia se encuentran asociados a todas estas estructuras anatómicas: glía (CG) de la corteza en las regiones corticales, astrositos-como glia (ALG) y glía envolvente (GE) en las regiones de neuropilos, glia envolvente también están asociados con tractos axón central y periférico nervios (EGN) y por último, dos de hoja-como glia, glia perineurial (PG) y subperineurial (SPG), que juntos forman una capa contigua que cubre el entero NS (figura 2).
Estudios anteriores han demostrado que glía desempeñan un papel importante en el desarrollo del NS; monitorear el número de células neuronales reaccionando a la circulación sistémica péptidos similares a la insulina, proporcionan apoyo trófico para las neuronas, como la lanzadera de lactato astrositos-neurona y eliminar las neuronas moribundas por fagocitosis3,4 , 5 , 6. en el NS maduro, glia mantener el BBB, tomar neurotransmisores y mantener la homeostasis iónica, actúan como las principales células inmunes en el NS, puesto que los macrófagos no incumple el BBB y modulan la actividad sináptica así como el comportamiento de los animales6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
Si los diferentes subtipos gliales realizan funciones especializadas, sigue siendo una incógnita importante. Sin embargo, un análisis sistemático del genoma de glia, especialmente en el adulto, se ha visto obstaculizado por la falta de adecuadas herramientas genéticas para su manipulación. Aquí, se presenta un método que permite la caracterización eficiente y fácil de las formas de la célula para el estudio de las interacciones célula-célula compleja. Esta técnica se ha aplicado para caracterizar la morfología de los diferentes subtipos gliales en el cerebro adulto de Drosophila , pero, según el driver específico de GAL4 utilizado, podría adaptarse para estudiar las neuronas12,13 , cualquier tipo de entrelazar las células y en principio cualquier tejido en cualquier fase del desarrollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un método sencillo y eficaz para estudiar la morfología de los diferentes tipos de células en un tejido de interés en alta resolución. Con la técnica MCFO, varios reporteros con epítopos diferentes etiquetas se utilizan en combinación para etiquetado estocástico multicolor (figura 2). Similar a otros métodos como Brainbow/Flybow15,16,17, MCFO aumenta la diversidad d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Arnim Jenett Aljoscha Nern y otros miembros del laboratorio Rubin de asesoramiento e intercambio de reactivos no publicados y el Janelia volar luz equipo de proyecto para la generación de imágenes confocales. Los autores también agradecen a los miembros del laboratorio galo de comentarios sobre el manuscrito.
Materials
| Water bath | Grant | GD100 | |
| PCR tubes | Sarstedt | 72.737.002 | |
| Forceps | Dumont | 11251-20 | |
| Dissecting dish 30 mm x 12 mmm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dish |
| Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate | Corning | 7223-34 | Glass dissection plates |
| Sylgard Black | SYLGARD, Sigma-Aldrich | 805998 | home made with charcoal |
| ExpressFive S2 cell culture medium | Invitrogen | 10486-025 | |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Roth | 3051.3 | |
| Normal goat serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | |
| Normal donkey serum | Jackson Laboratories | 017-000-121 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| Rabbit HA-tag | Cell Signaling | C29F4 | Primary antibody, dilution 1:500 |
| Rat FLAG-tag | Novus Biologicals | NBP1-06712 | Primary antibody, dilution 1:100 |
| Mouse V5-tag:DyLight 549 | AdSerotec | 0411 | Conjugated antibody, dilution 1:200 |
| anti-rabbit AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11034 | Secondary antibody, dilution 1:250 |
| anti-rat DyLight 647 | Jackson Laboratories | 712-605-153 | Secondary antibody, dilution 1:100 |
| Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SlowFate Gold | Invitrogen | S36937 | |
| Secure Seal Spacer | Grace Biolabs | Contact company for ordering | |
| Microscope cover glass 22 X 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Microscope cover glass 22 x 22 mm | Roth | H874 | |
| Stereo Microscope, Leica MZ6 | Leica | ||
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | ||
| Immersol | Zeiss | 518 F | Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free |
| Immersol | Zeiss | W 2010 | Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free |
| R56F03-GAL4 (EG) | Bloomington Stock Center | 39157 | GAL4 driver |
| R86E01-GAL4 (ALG) | Bloomington Stock Center | 45914 | GAL4 driver |
| hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5 | Bloomington Stock Center | 64085 | UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php) |
| Fiji (Image J) | Image analysis software | ||
| Multi Time Macro | Zeiss | Software for automated scanning |
References
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