Summary
Cellen weergeven van verschillende morphologies en stellen een verscheidenheid van interacties met hun buren. Dit protocol wordt beschreven hoe te onthullen van de morfologie van afzonderlijke cellen en cel-cel interactie onderzoeken met behulp van de gevestigde Gal4/UAS expressie systeem.
Abstract
Verschillende morphologies en complexe anatomische relaties worden weergegeven in cellen. Hoe de cellen communiceren met hun buren? Verschillen de interacties tussen celtypes of zelfs binnen een bepaald type? Wat voor soort ruimtelijk regels volgt ze? De antwoorden op deze fundamentele vragen in vivo hebben tot nu toe belemmerd door een gebrek aan hulpmiddelen voor het labelen van hoge resolutie eencellige. Hier vindt u een gedetailleerd protocol te richten op enkele cellen met een MultiColor FlpOut (MCFO) techniek. Deze methode is gebaseerd op drie anders tagged verslaggevers (HA, vlag en V5) onder UAS controle die stille worden gehouden door een transcriptionele terminator geflankeerd door twee FRT sites (FRT-stop-FRT). Een warmte-puls induceert de uitdrukking van een warmte schok-geïnduceerde Flp recombinase, die willekeurig de FRT-stop-FRT cassettes in afzonderlijke cellen verwijdert: expressie treedt alleen op in cellen die ook uitdrukking geven aan een GAL4 stuurprogramma. Dit leidt tot een matrix van verschillend gekleurde cellen van een bepaald celtype waarmee de visualisatie van individuele cel morphologies met hoge resolutie. Als voorbeeld, kan de MCFO-techniek worden gecombineerd met specifieke gliale GAL4-stuurprogramma's te visualiseren van de morphologies van de verschillende gliale subtypen van in de volwassen Drosophila hersenen.
Introduction
Glia, de bevolking van de non-neuronale cellen van het zenuwstelsel (NS), lang werden verondersteld een statische kader te bieden voor neuronen en daarom niet in detail zijn bestudeerd. Echter bij de mens, glia vormen de overgrote meerderheid van de cellen in de NS (~ 90%) en vallen in verschillende categorieën, met inbegrip van astrocyten, oligodendrocyten, microglia en cellen van Schwann. Glia vormen in Drosophila, ongeveer 10% van de cellen in de NS. Intrigerend, zijn hun morphologies en functies opvallend vergelijkbaar met die gevonden in gewervelde dieren1,2. Hun morphologies omvatten de bloed - hersen barrière (BBB) vormen epitheel, ensheathing en Astrocyt-achtige cellen.
De Drosophila centrale zenuwstelsel (CNS) bestaat uit de volgende belangrijkste structuren: cortex-regio's waarin de neuronale cel organen; neuropils die synaptic verbindingen haven; kleine en grote axon traktaten die verbinding maken met de verschillende neuropiles; perifere zenuwen die zintuiglijke organen en spieren met het CNS (Figuur 1 verbinden). Glia zijn gevonden die zijn gekoppeld aan alle van deze anatomische structuren: Cortex glia (CG) in de corticale gebieden, Astrocyt-achtige glia (ALG) en ensheathing glia (EG) in de neuropile regio's, ensheathing glia houden ook verband met centrale axon vezelbundels en perifere zenuwen (EGN), en ten slotte twee blad-achtige glia, perineurial glia (PG) en subperineurial (SPG), die vormen samen een aaneengesloten laag dat betrekking heeft op de hele NS (Figuur 2).
Eerdere studies hebben aangetoond dat glia spelen een belangrijke rol in de ontwikkeling van de NS; Zij bewaken van neuronale cel nummers door te reageren op insuline-achtige peptiden systemisch te circuleren, neuronen, zoals de Astrocyt-neuron lactaat shuttle, trofische ondersteunen en elimineren van stervende neuronen door fagocytose3,4 , 5 , 6. in de volwassen NS, glia behouden van de BBB, neurotransmitters innemen en handhaven van Ionische homeostase, fungeren als de grote immuuncellen in de NS, aangezien de macrofagen kunnen schenden de BBB en moduleren synaptic activiteit evenals dierlijk gedrag6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
Of gespecialiseerde functies worden uitgevoerd in de verschillende gliale subtypen blijft een belangrijk open vraag. Een systematische analyse van het genoom-brede van glia, vooral in de volwassen, heeft echter belemmerd door een gebrek aan passende genetische hulpmiddelen voor hun manipulatie. Hier, wordt een methode waarmee de karakterisering van het efficiënt en eenvoudig cel vormen om te studeren van complexe cel-cel interactie gepresenteerd. Deze techniek is vereffend karakteriseren de morfologie van de verschillende gliale subtypes in de volwassen hersenen Drosophila , maar, afhankelijk van de specifieke GAL4 stuurprogramma gebruikt, het zou kunnen worden aangepast om te bestuderen van neuronen12,13 , elke vorm van vermenging cellen, en in principe elk weefsel in elke ontwikkelingsstadia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiden vliegen voor experimenten MultiColor FlpOut (MCFO)
Opmerking: de MCFO techniek verwijst naar een gewijzigde versie van de zogenaamde Flp-gemedieerde stop cassette excisie (FlpOut). Transgene MCFO vliegen dragen een warmte schok promotor (hsp)-Flp recombinase en verschillende verslaggevers onder UAS. Elke verslaggever bestaat uit een gemeenschappelijke ruggengraat van een myristoylated (myr) super map groen fluorescent proteïne (sfGFP), in welke 10 exemplaren van een tag epitope (bv., HA, vlag of V5) zijn ingevoegd. De resulterende niet-belichting fluorescerende eiwitten heten " spaghetti monster GFPs " (smGFPs) 14 en kan worden opgespoord met behulp van specifieke antilichamen tegen de verschillende epitoop afsluitcodes.
- Kruis vliegt met de cassette MCFO en de hsp-Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) naar de desbetreffende gliale GAL4 stuurprogramma regels (zie tabel van materialen) .
- Zoals de hsp al actief bij 25 ° C is en weinig cellen kunnen ondergaan recombinatie leidt tot een aspecifieke labelen, opgericht kruisen bij 18 ° C om te voorkomen dat leakiness van het systeem. Wacht ongeveer 20 dagen bij 18 ° C tot het verkrijgen van de F1-generatie. Na de voorronde shock (zie stap 2), handhaven van vliegen bij 25 ° C ( Figuur 3).
2. Heat Shock
Opmerking: afhankelijk van de plaats van de invoegpositie, de efficiëntie van de hsp-Flp kan verschillen; daarom de optimale warmte schok tijd moet worden geoptimaliseerd. Voor dit protocol, een MCFO vliegen voorraad waarin de hsp-Flp is ingevoegd op het X-chromosoom is gebruikt (Zie Tabel of Materials).
- Overdracht die nakomelingen van het Kruis in stap 1.1 (F1 generatie vliegen, 3-4 dagen oud) in nieuwe flesjes met voedsel en warmte, schokken hen bij 37 ° C in een waterbad.
Opmerking: Jonge vliegen (1-2 dagen oud) zijn zeer gevoelig voor warmte schok. Wacht nog 1 of 2 dagen alvorens de warmte schok uit te voeren teneinde het sterftecijfer veroorzaakt door de behandeling. Gebruik enkele van de F1-generatie vliegt als een besturingselement, zonder warmte schok. - Tijdens de warmte schok, handhaven vliegen in normale flesjes met voedsel ter vermindering van het aantal stress-geïnduceerde sterfte. Zetten van de vrouwtjes en mannetjes in aparte flesjes.
- Zorg ervoor om te dompelen van het hele flesje in het water om de schok van een homogene warmte. Een schok van 5-8 min gebruiken als een geschikt uitgangspunt voor sparse labeling van glia cellen met veel GAL4 stuurprogramma lijnen; de schok duur moet worden geoptimaliseerd voor elke bestuurder en experiment (korter of langer warmte schok keer eventueel).
- Na de schok van de warmte, de flesjes horizontaal op de Bank voor een paar minuten te leggen zodat de vliegen om te herstellen van de schok van de hitte.
Opmerking: Het is niet nodig om te veranderen van de flesjes. - De vliegen bij 25 ° C te handhaven en ontleden (zie stap 3 en 4) ze 2 of meer dagen na de schok van de warmte voor optimale verslaggever expressie.
3. Voorbereiding van de dissectie en oplossingen
- de dag van de dissectie, bereid verse kleefpoeders oplossing in 200 µL PCR buizen door het mengen van 180 µL cultuurmedium van S2 cel met 20 µL van 20% paraformaldehyde (PFA) te verkrijgen van een 2% PFA-oplossing. Handhaven van de kleefpoeders oplossing op ijs, vóór en tijdens de dissectie.
Let op: PFA is giftig en moeten met zorg worden behandeld.
Opmerking: Meng 160 µL cultuurmedium van S2 cel met 40 µL van 20% paraformaldehyde (PFA) in een buis van 200 µL PCR te bereiden een 4% PFA-oplossing in plaats van een 2%-oplossingligttussen. - Gebruik van een PCR tube per genotype met een maximum van 8-10 hersenen per buis voor een optimaal resultaat van de kleuring.
- Bereiden de volwassen hersenen wassen oplossing: 0,5% bovien serumalbumine, 0,5% Triton X-100 in PBS.
Opmerking: Afhankelijk van de kleuring, een oplossing die 1% Triton X-100 kan nodig zijn. Een hogere concentratie van Triton X-100 verhoogt de penetratie van het antilichaam in het weefsel en het is nodig om de vlek-regio's die diep in het weefsel (bijvoorbeeld synaptic regio's in de volwassen hersenen Drosophila liggen). - Bereid de blokkerende oplossing: 0,5%, 3% normale geit serum en 3% normale ezel serum Triton X-100 in PBS.
- De volwassen hersenen wassen oplossing en de blokkerende oplossing kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor een paar weken.
- Diepe depressie wells glasplaat op ijs gezet en vul elk goed met de volgende oplossingen: één met 70% ethanol, een met PBS, en één met S2 cel kweekmedium.
4. Volwassen hersendissectie
- plaatst u een 3 cm schotel op het podium van een stereomicroscoop ontleden en vul deze met koud S2 cel kweekmedium. Voeren van alle de ontledingen in dit medium om ervoor te zorgen dat het weefsel gezond tijdens de procedure van de dissectie blijft.
Opmerking: Gebruik een ontleden schotel bekleed met enkele millimeters van zwarte siliconen waarmee een goede achtergrond contrast (in de beelden), en behoud van de verlostang tijdens de dissectie. - Anesthetize de vliegen met CO 2 met gewenste genotype.
- Met pincet, grijp de vlieg door de vleugels en wassen in koud 70% ethanol voor 30 s, vervolgens met koud PBS voor extra 30 s.
- Overbrengen van de vlieg in de diepe depressie goed dat gevuld is met S2 cel kweekmedium.
- Dezelfde procedure herhaal voor alle vliegen van de dezelfde genotype en deze handhaven in koude S2 cel kweekmedium tot dissectie, die de weefsel behouden zal.
Opmerking: Alleen het aantal vliegen die kan worden ontleed in een periode van ongeveer 30 min. lange incubatie keren in S2 cel kweekmedium aan het weefsel schade kan Anesthetize. - Pak het vliegen met een tang en, onder een stereomicroscoop, dompelen de vlieg in S2 cel kweekmedium.
- Losmaken het hoofd van de rest van het lichaam. Negeren van het lichaam en houd het hoofd ondergedompeld in S2 cel kweekmedium. Het is uiterst belangrijk te houden het hoofd met een Tang voor de gehele duur van de dissectie. Als het hoofd begint te zweven, het zal moeilijk zijn om zonder beschadiging van het weefsel worden opgehaald.
- Beginnen de dissectie door te trekken uit een oog, terwijl het hoofd met ten minste één pincet te allen tijde. Zorg ervoor dat het uiteinde van de verlostang is net onder het netvlies te vermijden beschadiging van het weefsel onder. Trek het andere oog en beginnen met het verwijderen van de cuticle, totdat de hersenen verschijnt.
- Verwijder alle tracheale weefsel en epidermis rond de hersenen totdat het weefsel schoon verschijnt. Zorg ervoor dat alle tracheale weefsel rond de hersenen voor een optimaal resultaat van de kleuring; verwijderen de weefsels zijn nu klaar om te worden vastgesteld en gekleurd.
- Behouden alle de ontleed hersenen in koude S2 cel kweekmedium vóór de overbrenging van hen in de PFA-oplossing om de tijd van de fixatie stap.
5. Volwassen hersenen kleuring
< ol>Opmerking: De incubatie tijden kunnen variëren afhankelijk van het type antilichaam gebruikt. Langer incubations kunnen nodig zijn.
- Voor het labelen van de drie MCFO markers, Incubeer de hersenen met anti-HA (1:500), Dizzee RASCAL (DYKDDDDK epitoop) (1:100), en de primaire antilichamen anti-V5.
- Primaire rechtstreeks-geconjugeerde antilichamen kunnen worden gebruikt in plaats van de normale combinatie van primaire + secundaire (bv., anti-V5:DyLight 549 (1:200)). In dit geval de direct-geconjugeerde antilichamen te behandelen als secundaire antilichamen.
Opmerking: Voor elk genotype, houden sommige hersenen als besturingselementen om te controleren of het specifieke karakter van de kleuring. Overslaan van het primaire antilichaam-incubatie en ga direct naar de volgende stap.
Opmerking: voorbeelden van passende antilichamen: AlexaFluor 488 (1:250), anti-V5:DyLight 549 (1:200) en DyLight 647 (1:100)-geconjugeerde antilichamen.
6. Montage van de hersenen voor Imaging
- Trim een imaging spacer om de juiste grootte met behulp van schaar. Voor hoge resolutie microscopie, sandwich het specimen en imaging tussenstuk tussen twee glas coverslips.
Opmerking: Imaging spacers zijn dunne (0,12 mm dik) zelfklevende spacers die schil en stok op glas coverslips of Microscoop dia's, zodat de montage van specimens zonder compressie. - Met pincet, de zelfklevende voering uit één oppervlak te verwijderen en toe te passen van de spacer, met de klevende kant naar beneden, op het oppervlak van een glas dekglaasje aan (22 mm x 60 mm). Breng 10 µL van montage medium een nieuwe glas dekglaasje aan.
- Met een P10 Pipetteer overbrengen in de hersenen van de buis 200 µL het dekglaasje aan, naast de daling van montage medium. Samen met de weefsels, overdracht van sommige PBS teneinde de hersenen in oplossing.
- Met een P10 Pipet, verplaatsen de hersenen van de PBS aan de daling van montage medium probeert om de hoeveelheid PBS te beperken. De modellen in de montage medium overdragen op het dekglaasje aan met de beeldvorming spacer. Genoeg montage media gebruiken ter dekking van het specimen.
- De andere zelfklevende voering uit de bovenkant van het tussenstuk verwijderen en toevoegen van een glas dekglaasje aan op de top van de specimens. Met het puntje van een pincet, een zachte druk van toepassing over het zelfklevende gebied te verzegelen. Afbeelding van de gekoppelde weefsels onmiddellijk of op te slaan van de dia's op-20 ° C voor een latere anayse.
7. Afbeelding van overname
- ophaal stapels confocal fluorescentie beelden met behulp van een confocal microscoop met een 40 X (NB = 1.2, water onderdompeling) doel of 63 X (NB = 1.4, olie-immersie) doelstelling (pixelgrootte = 1024 x 1024 in de xy-oppervlakte; Afstand tussen twee confocal secties = 0,5 µm). Aanpassen van de detector winst en offset in elk kanaal op zodanige wijze dat geen verzadigde pixels en nulwaarden pixel aanwezig in de beelden zijn; Dit voorkomt gegevensverlies en zorgt voor gebruik van het volledige dynamische bereik van de detector.
Opmerking: Aangezien 3D-beeldbewerking tijdrovend is, de metingen kunnen worden geautomatiseerd door het scannen van meerdere monsters parallel op verschillende locaties. Om te voorkomen dat de verdamping met de doelstelling van het water onderdompeling, gebruik speciale olie onderdompeling medium met brekingsindex n = 1.33. - Verwerken van de confocal stacks voor maximale dichtheid projecties, wijzigingen in kanaal tint en de aanpassing van helderheid en contrast met standaardimage analysesoftware (Zie Tabel of Materials).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze sectie ziet u voorbeelden van de resultaten die kunnen worden verkregen met behulp van de MCFO-techniek in de volwassen Drosophila hersenen. Figuur 3 ziet u een schematische voorstelling van de methode. Drie anders membraan-gelabeld verslaggevers (myr-smGFP-HA, myr-smGFP-FLAG en myr-smGFP-V5) onder UAS controle worden stil gehouden door een transcriptionele terminator geflankeerd door twee FRT sites (FRT-stop-FRT). Een warmte-puls induceert de uitdrukking van Flp recombinase die willekeurig de FRT-stop-FRT cassettes in afzonderlijke cellen verwijdert. Dit leidt tot een matrix van verschillend gekleurde cellen van een bepaald celtype, opgegeven door het GAL4 stuurprogramma gebruikt.
Overall, zeven kleuren zijn mogelijk. Figuur 4 en Figuur 5 vertonen de interne morphologies van de EG en ALG cellen de Drosophila antennal kwab (AL), respectievelijk. Steeds meer warmte schok induceert een verhoogd bedrag van gelabelde cellen, afhankelijk van het type van GAL4 de bestuurder, een eerste optimalisatie van de heat shock protocol is daarom noodzakelijk. Figuur 6 toont het labelen van de EG in de Drosophila optic kwab (OL) met één MCFO verslaggevers.
Figuur 1: Anatomie van de volwassen Drosophila NS. De corticale gebieden (gestippeld grijze gebieden) bevatten alle van de neuronale en de meeste van de gliale cel organen, terwijl de neuropile regio's (blauwe gebieden) de synaptische verbindingen bevatten. Tract gebieden (donkerblauw) verbinding maken met de verschillende neuropiles. Dit cijfer is gewijzigd van Kremer et al. (2017) 18. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: generieke gliale subtypen in de Drosophila CNS. Een membraan-gelabeld GFP (UAS-mCD8-GFP) verslaggever gedreven door specifieke stuurprogramma's van de GAL4 staat de visualisatie van de vijf generieke gliale subtypen (PG: perineurial glia, SPG: subperineurial glia, CG: cortex glia, ALG: Astrocyt-achtige glia en EG: ensheathing glia). De neuropil regio's (magenta gebieden) worden gedetecteerd met de presynaptische markering NC82 (BRUCHPILOT). Op de bodem, worden graven van de cel voor de verschillende gliale subtypen weergegeven. Schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: kruising regeling voor de MCFO techniek. Schematische voorstelling van de MCFO-techniek. Homozygousvirgins uitvoering van de cassette MCFO en de hsp-Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) zijn gekruist met specifieke homozygoot GAL4 stuurprogramma mannetjes. De F1-generatie is dan warmte geschokt. Volgens het aantal FRT-stop-FRT cassettes willekeurig verwijderd uit de verslaggevers, zijn zeven verschillende kleuren mogelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: morfologie van ensheathing glia (EG) in de antennal kwab (AL). Confocale z-stapels van Drosophila AL na wholemount immunokleuring. (A) morfologie van AL ontdekt met de presynaptische markering NC82 (BRUCHPILOT). (B-D) Stochastische etikettering van EGcells geïnduceerde doordat warmte schok keer: 8 min (B), 8,5 min (C) en 10 min (D). De EG te nemen op de vele verschillende vormen en maten, als ze ensheath het oppervlak van het AL. Neighboring BV cellen dekking vlakken maar gedeeltelijk interdigitate in regio's van de contactpersoon. Schaal bar = 20 µm. HA: humane influenza hemagglutinine. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: morfologie van Astrocyt-achtige glia (ALG) in de antennal kwab (AL). Confocale z-stapels van Drosophila AL na wholemount immunokleuring. (A) morfologie van de AL ontdekt met de presynaptische markering NC82 (BRUCHPILOT). (B-D) Stochastische labeling van ALG cellen veroorzaakt door toenemende warmte schok keer: 8 min (B), 10 min (C) en 15 min (D). ALG Toon variabele grootte en morphologies maar grotendeels niet-overlappende gebieden te bestrijken. Schaal bar = 20 µm. HA: humane influenza hemagglutinine. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: morfologie van ensheathing glia (EG) in de optiek kwab (OL). Confocale z-stapels van Drosophila OL na wholemount immunokleuring. (A-C) MCFO labelen met drie stop-cassette verslaggevers met HA, vlag en V5 myr-smGFPs. FLP recombinase werd veroorzaakt door een schok warmte 10 minuten bij 37 ° C. (A-C) Individuele MCFO verslaggevers en samenvoegen (D) worden weergegeven. Schaal bar = 20 µm. HA: humane influenza hemagglutinine. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een gemakkelijke en efficiënte methode om te studeren van de morfologie van de verschillende soorten cellen binnen een weefsel van belang op hoge resolutie. Met de MCFO techniek, worden meerdere verslaggevers met verschillende epitoop tags gebruikt in combinatie voor multicolor stochastische labeling (Figuur 2). Vergelijkbaar met andere methoden zoals zwHANSje/Flybow15,16,17, MCFO verhoogt de diversiteit van het label door markering coexpression, waardoor de visualisatie van de celgrenzen voor cel-cel interactie studies. Bijvoorbeeld, met drie verslaggevers zijn zeven potentiële marker combinaties mogelijk. Vergeleken met eerdere labeling methoden, de MCFO-techniek toont een meer precieze en gemakkelijk aansturing van de cel labeling dichtheid17: Flybow 1.0 vliegen express een standaard-merkteken waardoor eencellige labeling bemoeilijken; Flybow 2.0 vliegen vereisen de uitdrukking van twee verschillende Flp recombinases om het systeem ingewikkelder te maken.
Afhankelijk van de specifieke GAL4 stuurprogramma gebruikt, kan de MCFO techniek worden aangepast aan elk weefsel studeren aan elk ontwikkelingsstadium. Hier, is de techniek toegepast om het karakteriseren van de morfologie van de generieke gliale subtypes in de volwassen Drosophila hersenen met hoge resolutie. De veelkleurige etikettering van enkelvoudige cellen staat de visualisatie van de verschillende grenzen en helpt bij het begrijpen, bijvoorbeeld, de ruimtelijke interactie tussen twee aangrenzende cellen; Afgezien van de PNG en SPG cellen, die zijn bedoeld om formulier epitheel, alle andere gliale subtypen Toon tegels, is dat ze contact met hun gliale buren, minimaliseren terwijl het maximaliseren van contact met de omhuld neuronale compartiment (cel lichaam, axonen, dendrites, en synapsen). Niet alleen in hun lokale omgeving, maar ook in de verre omgeving18, sturen zij alle fijne lamellipodial of filopodial processen.
Voor het succes van dit protocol is het cruciaal om te vliegen bij 18 ° C aan de achterkant om te voorkomen dat leakiness in het systeem. Wanneer ontleden en gedurende de gehele kleuring procedure, is het belangrijk om te voorkomen dat schade aan het weefsel voor een optimaal resultaat van de kleuring. Tot slot twee technische aspecten moeten worden beschouwd: de warmte schok tijd bepaalt het bedrag van de cellen waarin de codes worden uitgedrukt. Een korte serie schok zal leiden tot de etikettering van een paar cellen, terwijl een lange warmte schok zal veroorzaken de expressie van tags in vele cellen tot het extreme geval waarin alle FRT-stop-FRT cassettes worden verwijderd uit de verslaggevers, in alle cellen. In dit geval zullen slechts één kleur (de samenvoeging van de drie epitoop tags) aanwezig zijn, de visualisatie van eencellige morphologies voorkomen. De warmte schok tijd varieert afhankelijk van de plaats van de invoegpositie van de hsp-Flp en het GAL4-stuurprogramma, een eerste optimalisatie stap kan dus nodig. De marker-expressie is willekeurig en kan niet worden gericht op een specifieke populaties van cellen gedreven door het GAL4 stuurprogramma. Binnen één cel, kunnen verschillende codes worden uitgedrukt zodat de antilichaam kleuring van naburige cellen met verschillende kleuren. Echter, soms meer dan één tag wordt uitgedrukt in één cel die leidt tot de overlapping van de twee kleuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs geen concurrerende of conflicterende belangen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Arnim Jenett Aljoscha Nern en andere leden van de Rubin laboratorium voor advies en delen van ongepubliceerde reagentia en het Janelia vliegen licht projectteam voor confocal afbeeldingen te genereren. De auteurs dank ook de leden van het laboratorium van Gallië voor opmerkingen op het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water bath | Grant | GD100 | |
| PCR tubes | Sarstedt | 72.737.002 | |
| Forceps | Dumont | 11251-20 | |
| Dissecting dish 30 mm x 12 mmm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dish |
| Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate | Corning | 7223-34 | Glass dissection plates |
| Sylgard Black | SYLGARD, Sigma-Aldrich | 805998 | home made with charcoal |
| ExpressFive S2 cell culture medium | Invitrogen | 10486-025 | |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Roth | 3051.3 | |
| Normal goat serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | |
| Normal donkey serum | Jackson Laboratories | 017-000-121 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| Rabbit HA-tag | Cell Signaling | C29F4 | Primary antibody, dilution 1:500 |
| Rat FLAG-tag | Novus Biologicals | NBP1-06712 | Primary antibody, dilution 1:100 |
| Mouse V5-tag:DyLight 549 | AdSerotec | 0411 | Conjugated antibody, dilution 1:200 |
| anti-rabbit AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11034 | Secondary antibody, dilution 1:250 |
| anti-rat DyLight 647 | Jackson Laboratories | 712-605-153 | Secondary antibody, dilution 1:100 |
| Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SlowFate Gold | Invitrogen | S36937 | |
| Secure Seal Spacer | Grace Biolabs | Contact company for ordering | |
| Microscope cover glass 22 X 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Microscope cover glass 22 x 22 mm | Roth | H874 | |
| Stereo Microscope, Leica MZ6 | Leica | ||
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | ||
| Immersol | Zeiss | 518 F | Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free |
| Immersol | Zeiss | W 2010 | Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free |
| R56F03-GAL4 (EG) | Bloomington Stock Center | 39157 | GAL4 driver |
| R86E01-GAL4 (ALG) | Bloomington Stock Center | 45914 | GAL4 driver |
| hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5 | Bloomington Stock Center | 64085 | UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php) |
| Fiji (Image J) | Image analysis software | ||
| Multi Time Macro | Zeiss | Software for automated scanning |
References
- Freeman, M. R., Doherty, J. Glial cell biology in Drosophila and vertebrates. Trends Neurosci. 29 (2), 82-90 (2006).
- Stork, T., Bernardos, R., Freeman, M. R. Analysis of glial cell development and function in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (1), 1-17 (2012).
- Corty, M. M., Freeman, M. R. Cell biology in neuroscience: Architects in neural circuit design: Glia control neuron numbers and connectivity. J Cell Biol. 203 (3), 395-405 (2013).
- Hidalgo, A., Kato, K., Sutcliffe, B., McIlroy, G., Bishop, S., Alahmed, S. Trophic neuron-glia interactions and cell number adjustments in the fruit fly. Glia. 59 (9), 1296-1303 (2011).
- Liu, J., Speder, P., Brand, A. H. Control of brain development and homeostasis by local and systemic insulin signalling. Diabetes Obes Metab. 16, Suppl 1. 16-20 (2014).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133 (3), 498-509 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Edenfeld, G., Stork, T., Klambt, C. Neuron-glia interaction in the insect nervous system. Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 34-39 (2005).
- Oland, L. A., Tolbert, L. P. Key interactions between neurons and glial cells during neural development in insects. Annu Rev Entomol. 48, 89-110 (2003).
- Stork, T., Sheehan, A., Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Neuron-glia interactions through the Heartless FGF receptor signaling pathway mediate morphogenesis of Drosophila astrocytes. Neuron. 83 (2), 388-403 (2014).
- Zwarts, L., Van Eijs, F., Callaerts, P.
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Svoboda, K., Rubin, G. M. Multiple new site-specific recombinases for use in manipulating animal genomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14198-14203 (2011).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (22), E2967-E2976 (2015).
- Viswanathan, S., Williams, M. E., Bloss, E. B., Stasevich, T. J., Speer, C. M., Nern, A., Pfeiffer, B. D., Hooks, B. M., Li, W. P., English, B. P., Tian, T., Henry, G. L., Macklin, J. J., Patel, R., Gerfen, C. R., Zhuang, X., Wang, Y., Rubin, G. M., Looger, L. L. High-performance probes for light and electron microscopy. Nat Methods. 12 (6), 568-576 (2015).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Hampel, S., Chung, P., McKellar, C. E., Hall, D., Looger, L. L., Simpson, J. H. Drosophila Brainbow: A recombinase-based fluorescence labeling technique to subdivide neural expression patterns. Nat Methods. 8 (3), 253-259 (2011).
- Hadjieconomou, D., Rotkopf, S., Alexandre, C., Bell, D. M., Dickson, B. J., Salecker, I. Flybow: Genetic multicolor cell labeling for neural circuit analysis in Drosophila melanogaster. Nat Methods. 8 (3), 260-266 (2011).
- Kremer, M. C., Jung, C., Batelli, S., Rubin, G. M., Gaul, U. The glia of the adult Drosophila nervous system. Glia. 65 (4), 606-638 (2017).
