초파리 Melanogaster 성인 간접 비행 근육의 광 단면 근육 면적 결정
Summary
우리는 초파리 성인 근육 질량을 결정 하는 간접적인 방법 근육 영역을 측정 하는 방법을 보고 합니다. 간접 비행을 분석 하 여 우리의 방법론의 응용 근육 Myotonic 영양 질병의 초파리 모델에서 설명 합니다.
Abstract
근육 질량을 낭비 하 고, 근육 위축으로 알려진 신경 근육 학 질병의 초파리 모델에 일반적인 표현 형 이다. 우리는 파리, 특히 dorso 경도 근육 (DLM), 위축 형 다른 유전적 원인에 의해 초래 하는 측정 대상 실험으로 간접 비행 근육 (IFMs)를 사용 했습니다. 이 프로토콜에서 우리 반 얇은 단면에 대 한 비행 흉부 근육을 포함 하는 방법, 근육과 주위 조직 사이 좋은 대조를 방법 및 반자동 수집 가능한 데이터의 광학 현미경 이미지를 처리 하는 방법을 설명 하 고 분석입니다. 우리는 방법론 파이프라인의 세 가지 특정 응용 프로그램을 설명합니다. 첫째, 우리가 어떻게 방법 myotonic 영양 플라이 모델; 근육 퇴보를 계량에 적용할 수 있는 표시 둘째, 근육 단면적의 측정 홍보 하거나 근육 위축 및 근육 퇴보; 방지 유전자를 식별 하는 데 도움이 수 있습니다. 셋째,이 프로토콜 후보 화합물은 크게 질병 유발 돌연변이 의해 유도 된 주어진된 위축 한 표현 형을 수정할 수 있는지 여부를 결정에 적용할 수 있는또는 환경 방 아 쇠.
Introduction
과일 파리의 흉부 비행 근육, 기능, 생리학 및 해부학 적 구분의 두 개의 서로 다른 클래스를 포함 합니다. 이 근육은: dorso 경도 (DLM)와 (DVM) dorso-복 부 근육 (그림 1), 및 동기 비행으로 구성 된 간접 비행 근육 (IFM), 제어 근육1,2. 이 근육은 함께 비행에 필요한 높은 기계적인 힘을 생성 합니다. 크기, 분포 및 rostro 꼬리 처리는 IFMs의 횡단 단면3 (그림 2A)에 대 한 쉬운 방향을 허용. 이러한 이유로, 우리는 이러한 근육 근육 위축 초파리 melanogaster에서 공부 하를 선택 했습니다.
그림 1입니다. 보여주는 간접적인 비행 근육 (IFMs) 배열 하는 과일 파리의 흉부의 도표. (왼쪽) 측면 보기 나타내고 (오른쪽) 가슴의 크로스 섹션을 나타냅니다. IFMs (레드)에서 Dorso 경도 (DLM) 근육의 구성 그리고 Dorso-복 부 (DVM) (녹색)에 근육.
조직 구조 및 조직학 섹션의 dorso 복 부 축 방향 제어할 보존 근육 단면적의 적절 한 평가 위해 중요 하다. 근육 구조를 유지 하기 위해 사용 하는 톰 린 슨 외 에서 수정 고정 혼합물 4 . 또한, 근육 내부 조직 이기 때문에, 초파리의 외 골격의 불 침투성 혼합물 대상 조직에 침투 수 없습니다 고정으로 문제를 이다. 이 문제를 회피, 비행 머리, 다리, 날개와 고정 혼합 입력을 허용 하는 구멍을 만드는 복 부의 마지막 2 개의 세그먼트를 제거 했습니다. 우리는 오스뮴 tetroxide (OsO4)5, 광범위 하 게 사용 되는 기능 지방을 수정 하는 치료를 포함 하는 고정 프로토콜의 일환으로 트리 글리세라이드를 포함 하 여. OsO4 cytological 수준에서 특히 매우 잘 대부분의 구조를 유지 하 고 동시에 이미지에 대 한 대비를 제공 합니다. 고정, 후 초파리 thoraces 횡단 반 얇은 단면 (1.5 µ m)에 대 한 수 지에 포함 했다. 향상 된 대비에 대 한 조직의 수 또한 얼룩이 질 톨루이와 블루. 완전 한 thoraces의 이미지 10 배에서 찍은 하 고 근육 지역 binarizing (같은 크기)의 이미지와 총 ImageJ 소프트웨어와 함께 근육 조직 (검은 픽셀)에 해당 하는 픽셀의 비율을 측정 하 여 계량 했다.
OsO4 와 솔루션 도입이 프로토콜의 농도의 증가 조직 준비 및 고정 혼합물에 수정 허용 근육 조직의 고유 보존. 이 프로토콜 저하 및 Myotonic 영양 장애 (DM) 등 신경 근육 퇴행 성 질환과 관련 된 매우 위축 한 조건에도 더 신뢰할 수 있는 샘플의 사후 분석을 만드는 조직의 변형 방지 때문입니다. 더 일반적인 형태로 DM 타입-1,이 희귀 한 유전적 장애 myotonic 영양 단백질 키 니 아 제 (DMPK) 성적표에 확장된 CUG 반복에 대 한 가져온입니다. 돌연변이 DMPK RNA 격리 Muscleblind 같은 핵 RNA 의무적인 단백질 (MBNL1-3; 폼 ribonuclear foci 집계 초파리에서 Muscleblind (Mbl))6. 근육 myosin 무거운 체인 발기인 (Mhc-Gal4)에서 250 CTG 반복 표현 하 여 Myotonic 영양의 초파리 모델을 생성 했습니다. 모델 파리 전형적인 최대 개최 ‘날개’ 형으로 날지 되었고 심각한 근육 그들의 IFMs (그림 2B)에서 쇠 약 했다. 우리 연구실에서 수행 하는 이전 연구는 IFMs의 근육 영역의 결정이 모델 파리7근육 위축 증의 다른 화학 또는 유전 한정자의 효과 계량 하는 신뢰할 수 있는 방법을 나타났습니다. 예를 들어, C 250 CTG를 표현 하는 파리에는 근육에 반복 하는 Mbl isoform의 overexpression 격리 하 여 Mbl 고갈 DM1 pathogenesis8 (그림 2C) 트리거 요인으로, 근육의 구조를 달성. Abp1, 입증 된 안티-DM1 활동9 (그림 2D) hexapeptide와 파리 DM 모델 먹이 후에 근육 영역 구출 되었다.
그림 2입니다. 수 지 포함 성인 thoraces의 dorsoventral 섹션 부 량이 고 (A-D) 표시 관련 genotypes 초파리 melanogaster 의 간접 비행 근육. (A) 제어 (영웅) 난다. (B) 비 코딩 CTG 250의 표정 근육에 반복 (UAS-CTG(250)x) 제어 파리에 비해 DLMs에서 근육의 감소를 발생. (C)이 근육 위축 형 Muscleblind (MblC)의 overexpression에 의해 구출 되었다 (UAS-CTG (250) UAS MblC x) 및 (D) 먹이 (UAS-CTG (250) x Abp1)에 hexapeptide Abp1와 모델의 파리. 모든 이미지에 지 면 위에. Transgenes는 Myosin 중 연쇄 발기인 (Mhc)를 사용 하 여 근육을 주도 했다-Gal4. (E) 제어 파리에 상대적으로 근육의 비율의 정량화 차이가 상당한 했다 확인 했다. 히스토그램 표시 수단 ± S.E.M. * *p< 0.01와 * p < 0.05 (Student´s t-검정). 눈금 막대: 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
여기 보고 방법은 근육 개발, 유지 보수 및 노화, 질병 병 리 및 마약 테스트 근육 조직 내 생 및 외부 요인에 응답 하는 방법에 대 한 신뢰할 수 있는 정보를 제공 하기 때문에 연구원에 게 관심이 될 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
초파리 melanogaster 인간의 신경 근육 학 질병7,,1011, Myotonic Dystrophies의 모양으로 특징을 포함 하 여 연구에 유용한 모델 임을 입증 되었습니다. 근육 위축입니다. 여기에 제시 된 프로토콜 발병 또는 플라이 모델에서 특정 질병의 진행으로 인 한 근육 퇴보를 측정을 위한 유용한 도구입니다. 예를 들어 따라 다양 한 연령대?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는이 프로토콜에 피드 백 및 개선에 대 한 변환 유전체학 그룹과 캐서린 J 핸 슨의 회원을 감사 하 고 싶습니다. 이 프로젝트는 연구 그랜트 SAF2015-64500-R, 유럽 지역 개발 기금, R.A 정부의 드 Economia y Competitividad에 의해 수 여를 포함 실시 했다.
Materials
| Image-J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Ultramicrotome | Leica | Leica UC6 | |
| Microscope | Leica | Leica MZ6 | Bright field technique. |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Several alternative providers exist. |
| Scissors | World Precision World | 14003 | Several alternative providers exist. |
| Embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70900 | Several alternative providers exist. |
| Glutaraldehyde | Fluka (Sigma) | 49624 | Toxic. |
| OsO4 | Polyscience | 0972A | Extremely toxic. |
| Propylene oxide | Sigma Aldrich | 82320-250ML | Extremely toxic. |
| resin (Durcupan) | Sigma Aldrich | 44611-44614 | Carcinogenic when it is unpolymerized. |
| Toluidine blue | Panreac | 251176 | Toxic. |
| Mountant Medium (DPX) | Sigma Aldrich | 44581 | Dangerous. |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-500G | Harmful. |
| Na2HPO4 | Panreac | 122507 | 0.2 M dilution. |
| NaH2PO4 | Panreac | 121677 | 0.2 M dilution. |
| Borax | Panreac | 3052 | Toxic. |
References
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