Drosophila Melanogaster yetişkin dolaylı uçuş kaslarının optik kesitsel kas alanı belirlenmesi
Summary
Biz kas kütlesi Drosophila erişkinlerde belirlemek için dolaylı bir yöntemidir kas alanı ölçmek için bir yöntem raporu. Miyotonik Distrofi hastalığı Drosophila modelinde metodolojimiz dolaylı uçuş analiz tarafından uygulanması kaslar göstermektedir.
Abstract
İsraf, kas kütlesi kas atrofi bilinen ortak bir fenotip Drosophila modelleri nöromüsküler hastalıklar olduğunu. Biz (IFMs) dolaylı uçuş kaslarının sinekler, özellikle dorso-boyuna kaslar (DLM), ölçü birimi tarafından farklı genetik nedenler atrofik fenotip getirdiği tabi deneysel olarak kullanmışlardır. Bu protokol için biz yarı ince kesit için sinek göğüs kasları katıştırmak, kas ve çevreleyen doku arasında iyi bir kontrast elde etmek ve yarı otomatik ölçülebilir veri edinimi için optik mikroskop görüntüleri işlemek anlatan ve analiz. Biz metodolojik boru hattı üç belirli uygulamaları açıklanmaktadır. İlk olarak, biz yöntemi miyotonik Distrofi sinek manken kas dejenerasyon ölçmek için nasıl uygulanabilir göstermek; İkinci olarak, kas kesit alanı ölçüm teşvik veya kas atrofi ve/veya kas dejenerasyonu önlemek genlerin tanımlamak için yardımcı olabilir; Üçüncü olarak, bu iletişim kuralı bir aday bileşik önemli bir hastalığa neden olan mutasyon bağlı belirli bir atrofik fenotip değiştirmek mümkün olup olmadığını belirlemek için uygulanabilirveya bir çevre tetikleyicisi tarafından.
Introduction
Meyve sineği Toraks işlevsel olarak, fizyolojik ve anatomik olarak ayrı olan uçuş kaslarının iki farklı sınıflar içerir. Bu kaslar: dorso-boyuna (DLM) ve dorso-ventral (DVM) kasları (şekil 1) ve zaman uyumlu uçuş oluşan dolaylı uçuş kasları (IFM), kontrol kas1,2. Bu kaslar birlikte uçmak için gerekli yüksek mekanik gücü oluşturmak. Boyutu, dağıtım ve IFMs rostro Kaudal bırakılmasını enine parça3 (şekil 2A) için kolay bir yönlendirme sağlar. Bu nedenle, biz bu kaslar kas atrofi Drosophila melanogasteriçinde çalışmaya seçtiniz.
Şekil 1. Diyagram dolaylı uçuş kasları (IFMs) düzenleme gösterilen meyve sineği Toraks. (Solda) bir lateral görünüm ve (sağ) bir kesit Toraks ve temsil eder. IFMs (kırmızı) Dorso-boyuna (DLM) kasları oluşur ve Dorso-ventral (DVM) (yeşil) kaslar.
Doku yapısı ve histolojik kesitler yönünü dorso-ventral ekseni kontrolünü korunması kas kesit alanı uygun değerlendirme sağlamak için kritiktir. Tomlinson ve ark. değiştiren bir fiksasyon karışımı kullanılan Kas yapısını korumak için 4 . Kaslar iç doku olduğu için Ayrıca, Drosophila‘ ın ezilecektir sızdırmazlık bir fiksasyon karışımları hedef dokulara nüfuz edemez olarak sorundur. Bu sorunu aşmak için sinek baş, bacaklar, kanatları ve son iki parça girmek fiksasyon karışımı izin delik oluşturmak için karın kaldırıldı. Biz tedavi ile yoğun yağ düzeltmek için onun yetenek nedeniyle kullanılan, Osmiyum tetroxide (OsO4)5, dahil fiksasyon protokolünün parçası olarak trigliserid de dahil olmak üzere. OsO4 çoğu yapıları son derece iyi, özellikle saytolojik düzeyinde korur ve aynı zamanda görüntünün kontrast sağlar. Fiksasyon sonra Drosophila thoraces reçine enine yarı ince parça (1,5 µm) için gömülü. Geliştirilmiş kontrast için doku Ayrıca toluidin ile mavi Boyanabilen. Tam thoraces görüntüleri 10 X alındı ve kas alan görüntüler (boyutlarının eşit) binarizing ve yüzde toplam, ImageJ yazılımı ile dışarı kas dokusu (siyah piksel) karşılık gelen piksel miktarının sayılabilir.
Değişikliklere doku hazırlık ve fiksasyon karışımları, bu protokol için tanıttı OsO4 ve oxazolidin çözüm, konsantrasyon artış olarak üzerinde benzersiz kas dokusunun korunması izin. Bunun nedeni protokol bozulması ve deformasyon bile son derece atrofik koşullarında nöromüsküler dejeneratif hastalıklar gibi miyotonik Distrofi (DM) ile ilişkili posterior analiz örnekleri daha güvenilir hale dokusunun önler. Daha yaygın şekliyle, DM tip 1, genişletilmiş CUG tekrarlar miyotonik Distrofi protein kinaz (DMPK) Tutanaklar içinde tarafından bu nadir genetik bozukluk getirdiği. Mutant DMPK RNA Muscleblind gibi nükleer RNA bağlanıcı proteinler (MBNL1-3; çekilmek formu ribonuclear foci toplar Muscleblind (Mbl) Drosophila)6. Miyotonik Distrofi Drosophila modelinin 250 CTG tekrarlar kas myosin ağır zincir organizatörü (Mhc-Gal4) altında ifade ederek oluşturulan. Modeli sinekler ile tipik ‘kanat’ up düzenlenen fenotip uçamayan ve ciddi kas atrofi onların IFMs (şekil 2B) vardı. Önceki çalışmalarda bizim laboratuarda gerçekleştirilen IFMs kas alanının belirlenmesi bu modeli sinekler7kas atrofi, farklı kimyasal ve genetik değiştirici etkilerini ölçmek için güvenilir bir yöntem olduğunu göstermiştir. Örneğin, 250 CTG ifade sinekler C’de kas içinde tekrarlar Mbl izoformu overexpression elde kas alanının bir kurtarma Mbl tükenmesi haciz tarafından DM1 Patogenez8 (şekil 2C) tetikleyici faktör olduğu gibi. Abp1, bir hexapeptit kanıtlanmış anti-DM1 etkinlik9 (şekil 2B) ile DM modeli besleme uçar kas alanı da kurtarıldı.
Şekil 2. Miktar’dorsoventral yetişkin thoraces reçine gömülü bölümlerinden. (A-D) dolaylı uçuş kaslarının Drosophila melanogaster belirtilen ilgili genotip ile. (A) denetim (yw) uçar. (B) ifade CTG kodlamayan 250 tekrarlar kas (UAS-CTG(250)x) bir azalma kas alan DLMs içinde denetim sinekler ile karşılaştırıldığında neden oldu. (C) bu kas atrofi fenotip Muscleblind (MblC) overexpression tarafından kurtarıldı (UAS-CTG (250) UAS MblC x) ve (D) beslenme modeli sinekli hexapeptit Abp1 (UAS-CTG (250) x Abp1). Tüm görüntüleri üst dorsal ve takımıdır. Transgenes bir Myosin ağır zinciri organizatörü (Mhc) kullanarak kas için tahrik-Gal4. (E) denetim sinekler göre kas alanının yüzdesi miktar farkları önemli olduğunu doğruladı. Histogram gösterir anlamına gelir ± S.E.M. **p< 0,01 ve * p < 0,05 (Student´s t-Testi). Ölçek çubuğu: 200 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Rapor burada yöntem kas geliştirme, bakım ve yaşlanma, hastalık patoloji ve kas dokusu endojen ve dış faktörler nasıl yanıt vereceğini hakkında güvenilir bilgi sağlar gibi uyuşturucu testi odaklanarak araştırmacılar için ilgi olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila melanogaster görünümünü tarafından karakterize miyotonik Dystrophies de dahil olmak üzere insan nöromüsküler hastalıklar7,10,11, çalışmaya uzun bir faydalı model olduğunu kanıtlanmıştır kas atrofisi. Burada sunulan Protokolü başlangıçlı veya sinek modeli belirli bir hastalık progresyon kaynaklanan kas dejenerasyon miktarının için yararlı bir araçtır. Örneğin, takip etmek ve f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar bu protokol üzerinde translasyonel genomik grubunun üyeleri ve Kathryn J Hanson geri besleme ve gelişmeler için teşekkür etmek istiyorum. Bu proje araştırma hibe SAF2015-64500-ambulans için “gayri resmi” de Economia y Competitividad tarafından verilen Avrupa Bölgesel Kalkınma fonları içerir R ile gerçekleştirilmiştir.
Materials
| Image-J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Ultramicrotome | Leica | Leica UC6 | |
| Microscope | Leica | Leica MZ6 | Bright field technique. |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Several alternative providers exist. |
| Scissors | World Precision World | 14003 | Several alternative providers exist. |
| Embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70900 | Several alternative providers exist. |
| Glutaraldehyde | Fluka (Sigma) | 49624 | Toxic. |
| OsO4 | Polyscience | 0972A | Extremely toxic. |
| Propylene oxide | Sigma Aldrich | 82320-250ML | Extremely toxic. |
| resin (Durcupan) | Sigma Aldrich | 44611-44614 | Carcinogenic when it is unpolymerized. |
| Toluidine blue | Panreac | 251176 | Toxic. |
| Mountant Medium (DPX) | Sigma Aldrich | 44581 | Dangerous. |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-500G | Harmful. |
| Na2HPO4 | Panreac | 122507 | 0.2 M dilution. |
| NaH2PO4 | Panreac | 121677 | 0.2 M dilution. |
| Borax | Panreac | 3052 | Toxic. |
References
- Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. Development of the indirect flight muscles of Drosophila. Development. 113, 67-77 (1991).
- Fernandes, J. J., Keshishian, H. Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds. Development. 122, 3755-3763 (1996).
- Hartenstein, V. Atlas of Drosophila Development. Atlas Drosoph. Dev. , 1-57 (1993).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Cell fate in the Drosophila ommatidium. Dev. Biol. 123, 264-275 (1987).
- Griffith, W. P. Osmium Tetroxide And Its Applications. Platin Met Rev. 18, 94-96 (1974).
- Bird, T. D. Myotonic Dystrophy Type 1. GeneReviews. 1, 1-23 (1993).
- Bargiela, A., et al. Increased autophagy and apoptosis contribute to muscle atrophy in a myotonic dystrophy type 1 Drosophila model. Dis Model Mech. 8, 679-690 (2015).
- Llamusi, B., et al. Muscleblind, BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model. Dis. Model. Mech. 6, 184-196 (2012).
- García-López, A., Llamusí, B., Orzáez, M., Pérez-Payá, E., Artero, R. D. In vivo discovery of a peptide that prevents CUG-RNA hairpin formation and reverses RNA toxicity in myotonic dystrophy models. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11866-11871 (2011).
- van der Plas, M. C., et al. Drosophila Dystrophin is required for integrity of the musculature. Mech. Dev. 124, 617-630 (2007).
- Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann New York Acad Sci. , 1184 (2010).
- Babcock, D. T., Ganetzky, B. An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila. J. Vis. Exp. , e51223 (2014).
