Optisk Cross-Sectional muskel området fastsettelse av Drosophila Melanogaster voksen indirekte flygingen musklene
Summary
Vi rapporterer en metode å kvantifisere muskelområdet, som er en indirekte metode for å bestemme muskelmasse i Drosophila voksne. Viser vi anvendelsen av vår metode ved å analysere indirekte flyturen muskler i Drosophila modell av Myotonic Dystrophy sykdom.
Abstract
Muskelmasse herjer, er kjent som muskelatrofi, en vanlig fenotypen i Drosophila modeller av neuromuscular sykdommen. Vi har brukt indirekte flygingen musklene (IFMs) flyr, spesielt dorso-langsgående musklene (DLM), som den eksperimentelle kan måle atrofier fenotypen forårsaket av forskjellige genetiske årsaker. I denne protokollen, beskriver vi hvordan du bygger inn fly thorax muskler semi tynn snitting, hvordan å få en god kontrast mellom muskler og de omkringliggende vev og hvordan å behandle optisk mikroskop bilder for halvautomatisk oppkjøpet av kvantifiserbare data og analyse. Vi beskriver tre spesifikke programmer av metodologiske rørledningen. Først viser vi hvordan metoden kan brukes for å kvantifisere muskel forverring av myotonic dystrophy fly modell; andre kan måling av muskel tverrsnitt bidra til å identifisere tilblivelse det fremme eller hindrer muskelatrofi og/eller muskel degenerasjon; tredje denne protokollen kan brukes for å fastslå om en kandidat sammensatt betydelig endre en gitt atrofier fenotypen indusert av en sykdom-forårsaker mutasjoneller en miljømessig utløse.
Introduction
Thorax frukt fly inneholder to forskjellige klasser av flygingen musklene, som er funksjonelt, fysiologisk og anatomisk distinkte. Disse musklene er: indirekte flygingen musklene (IFM), som består av en dorso-langsgående (DLM) og dorso-ventrale (DVM) muskler (figur 1) og synkrone flyturen kontrollere muskler1,2. Disse musklene generere sammen opphøyet mekanisk kraft som kreves for fly. Størrelse, distribusjon og rostro-caudal disponeringen av IFMs tillater en enkel retning for tverrgående snitt3 (figur 2A). Derfor har vi valgt disse musklene å studere muskelatrofi i Drosophila melanogaster.
Figur 1. Diagram over thorax frukt fly viser indirekte flygingen musklene (IFMs) arrangement. (Til venstre) representerer en lateral visning og (høyre) representerer et tverrsnitt av pronotum. IFMs består av Dorso-langsgående (DLM) musklene (i rødt) og Dorso-ventrale (DVM) muskler (i grønt).
Vevet struktur og kontroll over dorso-ventrale aksen retning av histologiske deler er avgjørende for å sikre riktig vurdering av muskel tverrsnitt. Å bevare muskel vi brukte en fiksering blanding endret fra Tomlinson et al. 4 . Videre fordi musklene er interne vev, er varmeisolerende av Drosophilaexoskeleton et problem som fiksering blandinger ikke kan trenge gjennom på målet vev. For å omgå dette problemet, fjernet vi fly hodet, Ben, vinger og de to siste segmentene av magen til å lage hull som tillot fiksering blandingen inn. Som en del av fiksering protokollen vi inkludert behandling med osmium tetroxide (OsO4)5, som er mye brukt fordi det er mulighet for å fikse fett, inkludert triglyserider. OsO4 beholder de fleste strukturer svært godt spesielt på fargemaskin nivå og samtidig gir kontrast til bildet. Etter fiksering, var Drosophila thoraces innebygd i harpiks for tverrgående semi tynne snitt (1,5 µm). Økt kontrast, kan vev være i tillegg farget med toluidine blå. Bilder av komplett thoraces ble tatt i 10 X og muskelområdet ble kvantifisert ved binarizing bilder (av samme dimensjoner) og kvantifisere andelen bildepunkter som tilsvarer muskelvev (svart piksler) av totalt, med ImageJ programvare.
Endringer på vev forberedelse og fiksering blandinger, som økningen av konsentrasjonen av OsO4 og glutaraldehyde løsning, introdusert i denne protokollen, tillatt unike bevaring av muskelvev. Dette er fordi protokollen unngår fornedrelse og deformasjon av vev, gjør bakre analyse av prøvene mer pålitelig selv i svært atrofier betingelsene knyttet nevromuskulær degenerative sykdommer som Myotonic Dystrophy (DM). I sin vanligste form, DM type 1, er denne sjeldne genetisk lidelse forårsaket av utvidet CUG gjentar i myotonic dystrophy protein kinase (DMPK) utskrifter. Mutant DMPK RNA samler skjemaet ribonuclear foci som beslaglegge Muscleblind-lignende kjernefysiske RNA-bindende proteiner (MBNL1-3; Muscleblind (Mbl) i Drosophila)6. Vi generert en Drosophila modell av Myotonic Dystrophy ved å uttrykke 250 CTG gjentas under muskel myosin tunge kjeden arrangøren (Mhc-Gal4). Modellen var fly med en typisk “opp-holdt wings’ fenotypen og hadde alvorlige muskel atrofi i deres IFMs (figur 2B). Tidligere studier utført i vårt laboratorium har vist at fastsetting av muskel IFMs er en pålitelig metode å kvantifisere effekten av ulike kjemiske eller genetisk modifikatorer av muskelatrofi i disse modellen flyr7. Som et eksempel oppnådd overuttrykte Mbl isoformen C i fluer uttrykke den 250 CTG gjentar i muskler, en redning av muskel som Mbl uttømming av lagring er den utløsende faktoren i DM1 patogenesen8 (figur 2C). Muskelområdet ble også reddet etter fôring DM modellen flyr med Abp1, en hexapeptid med påvist anti-DM1 aktivitet9 (figur 2D).
Figur 2. Kvantifisering av dorsoventral deler av harpiks-embedded voksen thoraces. (A-D) indirekte flygingen musklene Drosophila melanogaster med de angitte relevante genotyper. (A) kontroll flyr (yw). (B) uttrykk for 250 ikke-koding CTG gjentar i muskel (UAS-CTG(250)x) forårsaket en reduksjon av muskelområdet i DLMs i forhold til kontrollen fluer. (C) denne muskelen atrofi fenotypen ble reddet av overuttrykte Muscleblind (MblC) (UAS-CTG (250) x UAS-MblC) og (D) modell fluer med hexapeptid Abp1 (UAS-CTG (250) x Abp1). Alle bilder er dorsal side på toppen. Effekter av transgener ble kjørt til muskel ved hjelp av en Myosin tunge-kjeden promoter (Mhc)-Gal4. (E) kvantifisering av muskelområdet i forhold til kontrollen fluene bekreftet at forskjellene var betydelig. Histogrammet viser betyr ± S.E.M. **p< 0,01 og * p < 0,05 (Student´s t-test). Skala bar: 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Metoden her rapportert vil være av interesse for forskere muskelutvikling, vedlikehold og aldring, sykdom patologi og narkotikatesting som det gir pålitelig informasjon om hvordan muskelvev reagerer på både endogene og eksterne faktorer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det har blitt demonstrert at Drosophila melanogaster er en nyttig modell å studere human neuromuscular sykdommen7,10,11, inkludert Myotonic Dystrophies, som er preget av utseendet på muskel atrofi. Protokollen presenteres her er et nyttig verktøy for å kvantifisere muskel degenerering forårsaket av utbruddet eller progresjon av sykdommen i en fly modell. For eksempel er det også mulig å følge og kvantifisere deg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke medlemmer av translasjonsforskning Genomics gruppe og Kathryn J Hanson for mate-rygg og forbedringer på denne protokollen. Dette prosjektet ble gjennomført med forskningsstipend SAF2015-64500-R, som inkluderer europeiske regionale bistandsmidler, tildeles grunnleggeren av Ministerio de Economia y Competitividad.
Materials
| Image-J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Ultramicrotome | Leica | Leica UC6 | |
| Microscope | Leica | Leica MZ6 | Bright field technique. |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Several alternative providers exist. |
| Scissors | World Precision World | 14003 | Several alternative providers exist. |
| Embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70900 | Several alternative providers exist. |
| Glutaraldehyde | Fluka (Sigma) | 49624 | Toxic. |
| OsO4 | Polyscience | 0972A | Extremely toxic. |
| Propylene oxide | Sigma Aldrich | 82320-250ML | Extremely toxic. |
| resin (Durcupan) | Sigma Aldrich | 44611-44614 | Carcinogenic when it is unpolymerized. |
| Toluidine blue | Panreac | 251176 | Toxic. |
| Mountant Medium (DPX) | Sigma Aldrich | 44581 | Dangerous. |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-500G | Harmful. |
| Na2HPO4 | Panreac | 122507 | 0.2 M dilution. |
| NaH2PO4 | Panreac | 121677 | 0.2 M dilution. |
| Borax | Panreac | 3052 | Toxic. |
References
- Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. Development of the indirect flight muscles of Drosophila. Development. 113, 67-77 (1991).
- Fernandes, J. J., Keshishian, H. Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds. Development. 122, 3755-3763 (1996).
- Hartenstein, V. Atlas of Drosophila Development. Atlas Drosoph. Dev. , 1-57 (1993).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Cell fate in the Drosophila ommatidium. Dev. Biol. 123, 264-275 (1987).
- Griffith, W. P. Osmium Tetroxide And Its Applications. Platin Met Rev. 18, 94-96 (1974).
- Bird, T. D. Myotonic Dystrophy Type 1. GeneReviews. 1, 1-23 (1993).
- Bargiela, A., et al. Increased autophagy and apoptosis contribute to muscle atrophy in a myotonic dystrophy type 1 Drosophila model. Dis Model Mech. 8, 679-690 (2015).
- Llamusi, B., et al. Muscleblind, BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model. Dis. Model. Mech. 6, 184-196 (2012).
- García-López, A., Llamusí, B., Orzáez, M., Pérez-Payá, E., Artero, R. D. In vivo discovery of a peptide that prevents CUG-RNA hairpin formation and reverses RNA toxicity in myotonic dystrophy models. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11866-11871 (2011).
- van der Plas, M. C., et al. Drosophila Dystrophin is required for integrity of the musculature. Mech. Dev. 124, 617-630 (2007).
- Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann New York Acad Sci. , 1184 (2010).
- Babcock, D. T., Ganetzky, B. An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila. J. Vis. Exp. , e51223 (2014).
