هذا الفيديو يظهر الداخلي لتوليد الخلايا العصبية من الثقافات الجنين في وقت متأخر وأوائل القشرة الماوس بعد الولادة. ويمكن استخدام هذه الثقافات للكيمياء سيتولوجية مناعية ، والكيمياء الحيوية ، الفيزيولوجيا الكهربية والكالسيوم والصوديوم والتصوير ، وتوفير منبر لدراسة تطور الخلايا العصبية من الحيوانات المعدلة وراثيا التي تحمل بعدها طفرة جينية قاتلة.
Abstract
وهذا الفيديو دليل لكم من خلال عملية لتوليد الخلايا العصبية الثقافات القشرية من جنين في وقت متأخر ومخ الفأر في وقت مبكر بعد الولادة. ويمكن استخدام هذه الثقافات لمجموعة متنوعة من التطبيقات بما في ذلك كيمياء سيتولوجية مناعية والكيمياء الحيوية والكهربية ، والتصوير الكالسيوم والصوديوم والبروتين و / أو RNA العزلة. هذه الثقافات كما توفر منبرا لدراسة تطوير الخلايا العصبية من الحيوانات المعدلة وراثيا التي تحمل الجنين في وقت متأخر بعد الولادة أو طفرة جينية قاتلة. هذا الإجراء هو نسبيا على التوالي إلى الأمام ، ويتطلب بعض الخبرة في مجال تقنية زراعة الأنسجة ، وينبغي ألا يستغرق وقتا أطول من ساعتين الى ثلاث ساعات إذا كان قد أعد عليك بشكل صحيح. والفصل الدقيق للقشرة القشرية من السبيل المهادي القشري الألياف تقلل من عدد الخلايا العصبية غير المرغوب فيها. لزيادة الغلة من الخلايا العصبية متمزج قطعة من نسيج قشري بلطف بعد خطوة حضانة الانزيم. هذا أمر حتمي لأنه يمنع الاصابة لا لزوم لها على الخلايا المبكرة وموت الخلايا العصبية. لأن الحفاظ على هذه الثقافات في غياب الخلايا الدبقية المغذية ، كما أنها توفر ميزة إضافية للثقافات النمو المخصب في الخلايا العصبية.
Protocol
الاستعدادات قبل يوم من زراعة : تحضير محلول معقم تشريح (DS). إعداد NBM/B27 (Mediom Neurobasal مع ملاحق B27). الأوتوكلاف DDH 2 O وتعقيم coversilps الزجاج ، وإذا لزم الأمر. <li style=";text-al…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
5-Fluoro-2′-deoxyuridine
Sigma
F0503
Sodium Chloride
Sigma
S9625
Vibraslicer
Campden Instruments Ltd.
Potassim Chloride
Sigma
P4504
Sodium Phosphate Dibasic
Sigma
S0876
Potassium Phosphate Monobasic
Sigma
P5379
Hepes
Sigma
H3375
D (+)-Glucose
Sigma
G8270
Sucrose
Sigma
S0389
Poly-D-Lysine
Sigma
P7280
B27 Supplement
Invitrogen (Gibco)
17504-044
Neurobasal Media (NBM)
Invirtogen (Gibco)
21103-049
2-Amino-5-phosphonopentanoic acid
Sigma
A5282
Bovine Albumin
Sigma
A7030
Trypsin Inhibitor
Sigma
T9253
Sodium Hydroxide, 1N solution
Fisher
SS266-1
L-Cysteine
Sigma
C7755
Bacto Agar
Difco
0140-01
Papain
Worthington
LS 03126
Sterile 0.2 µm Syringe Filter
Fisher
DDA02025S0
Glass Coverslips, No1, Ø12mm
Bellco Glass Inc.
1943-00012
Minimum Essential Media (MEM)
Invitrogen (Gibco)
11090-081
with Earle’s salts
without L-glutamine, needed for growing non-neuronal cultures
Penicillin/Streptomycin
Invitrogen (Gibco)
15070-063
for non-neuronal culture
Fetal Bovine Serum
Invitrogen (Gibco)
16140-071
needed for non-neuronal cultures
Nunclon “Triple Flask” Tissue Culture Bottle
Fisher
12-565-25
Use for non-neuronal cultures. these flasks are very convenient when producing “conditioned Neurobasal Media/B27”, but any other tissue culture flasks or dishes can be used instead.
Glass bottom “Imaging dishes”
MatTek Corp.
P35G-1.5-10-C
Glass bottomed, Ø35mm culture dishes ideal for Calcium or Sodium Imaging when using an inverted imaging setup. But expensive!