דיסקציה של הרשתית האנושית ואת RPE-Choroid לניתוח פרוטיאומיה מבנית
Summary
הרשתית האנושית מורכבת מולקולרי ושאיכות אזורים הנבדלים זה מזה, לרבות fovea, macula, הרשתית ההיקפית. כאן, אנו מתארים שיטה באמצעות ניקוב ביופסיות להסרה ידנית של רקמות שכבות מן העין האנושית כדי לנתח ולאסוף אלה אזורים הנבדלים זה מזה ברשתית לניתוח פרוטיאומיה מבנית במורד הזרם.
Abstract
הרשתית האנושית מורכבת את neuroretina חישה ברשתית כבסיס פיגמנט האפיתל (RPE), אשר הוא ומורכבת בחוזקה על השכבה דמית העין כלי הדם. אזורים שונים של הרשתית מופרדים מבחינה אנטומית, מולקולרי, הקלת פונקציות ייחודיות, הוכחת דיפרנציאלית ולרגישות למחלות. ניתוח פרוטיאומיה מבנית מכל סוג של אזורים אלה שכבות יכול לספק תובנות חיוני לתהליך מולקולריים של מחלות רבות, כולל ז ניוון מקולרי (AMD), סוכרת, גלאוקומה. עם זאת, הפרדת רשתית אזורים שכבות חיוני לפני ניתוח כמותי פרוטיאומיה מבנית יכול להתבצע. כאן נתאר שיטת ניתוח ואוסף של אזורים רשתית foveal מקולרי, ציוד היקפי, שבבסיס RPE-דמית העין מורכבת, מעורבים ביופסיות אגרוף אזוריות ו להסרה ידנית של רקמות שכבות של העין האנושית. עמודים מרחביות חד-ממדי, כמו גם ניתוח פרוטיאומיה מבנית במורד הזרם, כגון ספקטרומטר מסה טנדם-כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS/MS), ניתן להשתמש כדי לזהות חלבונים בכל אחת מהשכבות ברשתית גזור, חשיפת סמנים מולקולריים של מחלות רשתית.
Introduction
הרשתית, RPE דמית העין הן רקמות מורכבות המדגימים חשוב הבדלים אזוריים ביטוי חלבון, תפקיד פיזיולוגי ו susceptibilities פתולוגית1,2. לדוגמה, מחלות כגון ז ניוון מקולרי (AMD), רטיניטיס פיגמנטוזה, רטינופתיה הצפק במרכז כל להדגים לוקליזציה האופיינית בתוך fovea, macula, או רשתית לפריפריה1,3, 4,6. כאן, אנו מציגים שיטה הוכחת כמה ברורים רשתית אזורים ניתן לטעום באופן עצמאי. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לספק מדריך אמין עבור אוסף של דגימות רקמות מאזורים foveal מקולרי, היקפי של הרשתית האנושית ואת RPE-choroid לניתוח פרוטיאומיה מבנית. הרציונל שבבסיס פיתוח, שיטה זו היא בעזרת ניתוח פרוטיאומיה מבנית מסוימת ברשתית אזורים אלה, חשוב תובנות מולקולרי עשוי להיות מושגת לתוך הפונקציות הפיזיולוגיות ו pathophysiological של אזורים אלה.
גישה זו מבטיחה לחשוף את הבסיס פרוטיאומיה מבנית מחלה אזורית יחסית susceptibilities, וכדי להקל על זיהוי מטרות טיפוליות ספציפיות חדשות. אכן, חקירות פרוטיאומיה מבנית את הזגוגיות והאינטראקציה שלו עם הרשתית סיפקו תובנות מפתח ההרכב המולקולרי והתפקוד של רקמות בריאים וחולים –5,–7,–8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. עם זאת, ברור השוואתי פרוטיאומיה מבנית ניתוחים של אזורים הנבדלים זה מזה ברשתית חסרים. טכניקת יעזור לתמיכה מחקרים אלו נחוצים, במתן יתרונות על פני שיטות אחרות על ידי הפגנת גישה אוסף רקמה לשחזור ואמין. ויותר מכך, הגישה היא מאוד נגיש, ניצול של רקמה בגודל סטנדרטי וזמין אגרוף כלים ביופסיה. הטכניקה שלנו מדגיש את המתאים האיסוף והאחסון של רקמות עבור פרוטיאומיה מבנית, עיבוד, ביצוע שיקולים חשובים עבור חלבון יציבות והשפלה. לפיכך, שיטה זו היא המתאימה ביותר עבור חוקרים בהתחשב במורד הזרם אנליזה מולקולרית של גורמים פרוטיאומיה מבנית.
Protocol
Representative Results
Discussion
לאחר רקמת אוסף, דוגמת טיפול וטיפול הם שיקולים מכריע14. שימור בחנקן נוזלי הוא המועדף על קיבוע כימי, כפי האחרון עלול לגרום נזק למבנה חלבון, אשר יכול להטות את ניתוח במורד הזרם. בנוסף, חנקן נוזלי השימור היא המועדפת בשיטות שאינן כוללות הקפאת דגימות. ראוי לציין, פרר. et al. הראה הבדל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
שהתנהל הוא נתמך על ידי מענקים NIH [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698, R21AG050437], דוריס דיוק מענק קרן צדקה #: 2013103, ומחקר כדי למנוע עיוורון (RPB), ניו יורק. MT GV נתמכים על ידי NIH הענק T32GM007337.
Materials
| 4-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-34 | |
| 8-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-37 | |
| 0.12 Colibri Forceps | Stephens Instruments | S5-1145 | |
| Wescott Scissors | Sklar Surgical Instruments | 64-3146 | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | #022364111 | 1.5 mL |
| Liquid Nitrogen | Praxair, Inc. | 7727-37-9 [R] |
References
- Chirco, K. R., Sohn, E. H., Stone, E. M., Tucker, B. A., Mullins, R. F. Structural and molecular changes in the aging choroid: implications for age-related macular degeneration. Eye (Lond). , (2016).
- Zhang, P., et al. Defining the proteome of human iris, ciliary body, retinal pigment epithelium, and choroid. Proteomics. 16 (7), 1146-1153 (2016).
- Funke, S., et al. Glaucoma related Proteomic Alterations in Human Retina Samples. Sci Rep. 6, 29759 (2016).
- Decanini, A., et al. Human retinal pigment epithelium proteome changes in early diabetes. Diabetologia. 51 (6), 1051-1061 (2008).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Dissection of human vitreous body elements for proteomic analysis. J Vis Exp. (47), (2011).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Proteomic landscape of the human choroid-retinal pigment epithelial complex. JAMA Ophthalmol. 132 (11), 1271-1281 (2014).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. J Vis Exp. (50), (2011).
- Skeie, J. M., et al. Proteomic analysis of vitreous biopsy techniques. Retina. 32 (10), 2141-2149 (2012).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Proteomic interactions in the mouse vitreous-retina complex. PLoS One. 8 (11), e82140 (2013).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M. Translational vitreous proteomics. Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 204-208 (2014).
- Skeie, J. M., Roybal, C. N., Mahajan, V. B. Proteomic insight into the molecular function of the vitreous. PLoS One. 10 (5), e0127567 (2015).
- Velez, G., et al. Precision Medicine: Personalized Proteomics for the Diagnosis and Treatment of Idiopathic Inflammatory Disease. JAMA Ophthalmol. 134 (4), 444-448 (2016).
- Velez, G., et al. Proteomic analysis of elevated intraocular pressure with retinal detachment. Am J Ophthalmol Case Rep. 5, 107-110 (2017).
- Skeie, J. M., et al. A biorepository for ophthalmic surgical specimens. Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 209-217 (2014).
- Ferrer, I., et al. Brain protein preservation largely depends on the postmortem storage temperature: implications for study of proteins in human neurologic diseases and management of brain banks: a BrainNet Europe Study. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (1), 35-46 (2007).
- Ahmed, M. M., Gardiner, K. J. Preserving protein profiles in tissue samples: differing outcomes with and without heat stabilization. J Neurosci Methods. 196 (1), 99-106 (2011).
- Kanshin, E., Tyers, M., Thibault, P. Sample Collection Method Bias Effects in Quantitative Phosphoproteomics. J Proteome Res. 14 (7), 2998-3004 (2015).
- Crecelius, A., et al. Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE. Proteomics. 8 (6), 1276-1291 (2008).
- Oka, T., Tagawa, K., Ito, H., Okazawa, H. Dynamic changes of the phosphoproteome in postmortem mouse brains. PLoS One. 6 (6), e21405 (2011).
- Nagy, C., et al. Effects of postmortem interval on biomolecule integrity in the brain. J Neuropathol Exp Neurol. 74 (5), 459-469 (2015).
- Mukherjee, S., et al. Proteomic analysis of frozen tissue samples using laser capture microdissection. Methods Mol Biol. 1002, 71-83 (2013).
