Human netthinnen består av funksjonelt og molecularly atskilte områder, inkludert fovea, macula og eksterne netthinnen. Her beskriver vi en metode som bruker punch biopsier og manuell fjerning av vev lag fra en øyet å dissekere og samle disse forskjellige retinal regioner for nedstrøms proteomic analyse.
Human netthinnen består av sensorisk neuroretina og underliggende retinal pigmentert epitel (RPE), som er fast kompleksbundet på vaskulær choroid laget. Ulike regioner av netthinnen er anatomisk og molecularly tydelig, tilrettelegge unike funksjoner og demonstrere differensial mottakelighet for sykdom. Proteomic analyse av hver av disse regionene og lag kan gi viktig innsikt i molekylær prosessen med mange sykdommer, inkludert Age-Related Macular degenerasjon (AMD), diabetes mellitus og glaukom. Separasjon av netthinnen regioner og lag er imidlertid avgjørende før kvantitative proteomic analyse kan oppnås. Her beskriver vi en metode for disseksjon og samling av foveal, flekker og eksterne retinal regioner og underliggende RPE-akkord kompleks, regionale punch biopsier og manuell fjerning av vev lag fra en øyet. Endimensjonal SDS-side i tillegg til nedstrøms proteomic analyse, som flytende kromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS), kan brukes til å identifisere proteiner i hvert dissekert retinal lag, avslører molekylær biomarkers for retinal sykdom.
Netthinnen, RPE, og akkord er komplekse vev som viser viktige regionale forskjeller i protein uttrykk, fysiologisk funksjon og patologisk mottakelighet1,2. For eksempel demonstrere sykdommer som Age-Related Macular degenerasjon (AMD), retinitis pigmentosa og sentrale serous retinopati hver karakteristiske lokalisering i den fovea, macula eller netthinnen periferi1,3, 4,6. Her presenterer vi en metode demonstrere hvordan forskjellige retinal regioner kan prøves uavhengig. Det overordnede målet med denne metoden er å gi en samling av fra foveal, flekker og eksterne regioner av human netthinnen og RPE-akkord for proteomic analyse. Begrunnelsen for utvikling og bruk av denne teknikken er gjennom proteomic analyse av disse spesifikke netthinnen regioner, viktig molekylær innsikt kan oppnås i fysiologiske og patofysiologiske funksjonene i disse regionene.
Denne tilnærmingen lover å avsløre proteomic grunnlaget for relativ regionale sykdom mottakelighet, og å lette identifisering av nye konkrete terapeutiske mål. Faktisk har proteomic undersøkelser av linsen og dens interaksjon med netthinnen gitt innblikk i molekylær komposisjon og funksjon av friske og syke vev5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. imidlertid klart komparative proteomic analyser av forskjellige retinal regioner mangler. Teknikken hjelper for å støtte disse sårt tiltrengte studier, gir fordeler over andre metoder ved å demonstrere en pålitelig og reproduserbar vev samling tilnærming. Mer så, tilnærmingen er lett tilgjengelig, utnytter standardstørrelse og lett tilgjengelig vev punch biopsi verktøy. Våre teknikk understreker riktig innsamling og lagring av vev for proteomic behandling, noe som gjør viktige hensyn for protein stabilitet og fornedrelse. Dermed er denne metoden best egnet for etterforskere vurderer nedstrøms molekylær analyse av proteomic faktorer.
Etter vev er samling, prøve-håndtering og behandling avgjørende hensyn14. Bevaring i flytende nitrogen er foretrukket over kjemiske fiksering, som sistnevnte kan resultere i skade for proteinstruktur, som kan vri nedstrøms. I tillegg er flytende nitrogen bevaring foretrukket å metoder som ikke involverer frysing av prøver. Spesielt Ferrer et al. viste betydelige forskjeller i protein nivå mellom hjernen prøvene bevart på 4 ° C eller romtemperatur, sammenlignet med de lagret 0 °…
The authors have nothing to disclose.
VBM er støttet av NIH tilskudd [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 og R21AG050437], Doris Duke veldedige Foundation Grant #: 2013103, og forskning å hindre blindhet (RPB), New York, NY. MT og GV støttes av NIH gi T32GM007337.
4-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-34 | |
8-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-37 | |
0.12 Colibri Forceps | Stephens Instruments | S5-1145 | |
Wescott Scissors | Sklar Surgical Instruments | 64-3146 | |
Microfuge tubes | Eppendorf | #022364111 | 1.5 mL |
Liquid Nitrogen | Praxair, Inc. | 7727-37-9 [R] |