Bedömning av Endothelial celler med hjälp av 3D cellkultur och icke-Antikoagulerat helblod blodförtunnande och antiinflammatoriska egenskaper
Summary
Vi presenterar en in vitro- modell som tillåter studiet och analysen av koagulation i hela, icke-Antikoagulerat blod. Antikoagulation i systemet beror på naturliga antikoagulationseffekt av friska endotelceller och endotelceller aktivering kommer att resultera i koagulation.
Abstract
In vivo, endotelceller är avgörande för den naturliga antikoagulation cirkulerande blod. Endotelcell aktivering leder följaktligen till koagulation. Detta fenomen observeras i många kliniska situationer såsom organtransplantationer i närvaro av förformad anti givare antikroppar, inklusive xenotransplantation, liksom i ischemi/reperfusionsskada. För att minska djurförsök enligt 3R-standarder (minskning, ersättning och förfining), in vitro- modeller att studera effekten av endotelceller vore aktiveringen på koagulation önskvärt. Vanliga flatbädd system av endotelceller kultur ger dock förhållandet yta till volym 1-5 cm2 av endotel per mL blod, vilket inte räcker för naturliga, endotel-medierad antikoagulation. Odling av endothelial celler på microcarrier pärlor kan öka ytan till volym förhållandet till 40-160cm/2ml. Detta ökade förhållande är tillräcklig för att säkerställa den ”naturliga” antikoagulation helblod, så att användning av antikoagulantia kan undvikas. Här är ett in vitro- microcarrier-baserat system beskrivs att studera effekterna av genetisk modifiering av svin endotelceller på koagulering av hela, icke-Antikoagulerat blod. I den beskrivs assay, primära svin aorta endotelceller, antingen vildtyp (WT) eller transgena för mänskliga CD46 och thrombomodulin, var odlas på microcarrier pärlor och sedan utsätts för färska ritade icke-Antikoagulerat blod. Denna modell tillåter mätning och kvantifiering av cytokinfrisättning samt aktivering markörer av komplement och koagulation i blodplasman. Dessutom utfördes imaging av aktiverade endotelceller och deposition av immunglobuliner, komplement- och koagulering proteiner på endothelialized pärlor av konfokalmikroskopi. Denna analys kan också användas för att testa läkemedel som är tänkt för att förhindra endotelceller aktivering och därmed koagulation. Ovanpå dess potential att minska antalet djur som används för sådana utredningar, är beskrivna analysen enkel att utföra och konsekvent reproducerbara.
Introduction
Den vaskulära endotelet består av en enskiktslager av endotelceller (EG) som linje lumen av blodkärl. I en fysiologiska tillstånd, quiescent EG ansvarar för underhållet av en antikoagulans och antiinflammatoriska miljö. 1 detta medieras av uttrycket av antikoagulans och anti-inflammatoriska proteiner på EG yta. Exempelvis EG aktivering orsakas av ischemi/reperfusion skada eller vaskulär avstötning av (xeno-) transplanterade organ medför en förändring av endothelial ytan från en antikoagulans och anti-inflammatoriska tillstånd till en Pro koaguleringsmedlet och pro-inflammatoriska tillstånd. 1
För att studera fascinerande och komplexa samspelet mellan de endotel och koagulation faktorerna, in vitro- modeller som efterliknar som nära som möjligt i vivo situationen är mycket önskvärda. En vanlig begränsning som kännetecknar konventionella in vitro- koagulering analyser är användningen av Antikoagulerat blod vilket gör analysen av koagulation-medierade effekter mödosam och även recalcification citrerade helblod kan inte återge resultat kan erhållas med färska icke-Antikoagulerat blod. 2 dessutom i traditionella platt-säng cell kultur system är det omöjligt att utnyttja endotelet antikoagulerande egenskaper som en tillräcklig endotelceller yta per blodvolym inte kan nås. Den modell som presenteras här övervinner dessa begränsningar av odlingsskålar EG på ytan av sfäriska microcarrier pärlor, så att en EG yta-till-blod förhållandet > 16 cm2/ml kan nås, som är liknande till situationen i små arterioler eller vener, och som beskrevs vara tillräcklig för att ”naturliga” antikoagulation av blod av EG ytan. 3 , 4 helblod kan användas utan tillsatt antikoagulantia i denna miljö. Blodprov kan tas under experimentet och cytokiner, koagulationsfaktorer och lösliga komplement aktiveringen markörer kan identifieras och kvantifieras. Dessutom kan EG-belagd microcarrier pärlor analyseras för komplement och immunglobulin nedfall samt uttrycket av EG aktiveringen markörer med konfokalmikroskopi. Ett annat intressant program inkluderar testning av narkotika som är tänkta för att förhindra endotelceller aktivering och därmed koagulation. 5 även om denna modell inte kan helt ersätta djurförsök, det erbjuder en metod för att testa specifika funktionella hypoteser ex vivo som använder celler och därmed minska antalet djur som används i grundforskning om ischemi/reperfusion skada eller (xeno) transplantation.
Den beskrivna modellen användes för att efterlikna en xenotransplantation inställning i vilka svin aorta endotelceller (Endometrial) odlas på microcarrier pärlor och inkuberas med hela, icke-Antikoagulerat blod. Olika transgena PAEC, bär flera mänskliga gener såsom CD46 för reglering av Komplementsystemet och/eller thrombomodulin (hTBM) för reglering av koagulationssystemet, analyserades för deras antikoagulerande egenskaper. Endotelcell aktivering, komplement och koagulation system kontrolleras tätt och sammankopplade. 6 det är därför viktigt att förstå hur de olika transgena cellerna beter sig efter exponering för humant blod när det gäller vidhäftning molekyl uttryck och cytokinfrisättning, avgivande av glykokalyx och förlust av antikoagulerande proteiner. 7
Protocol
Representative Results
Discussion
Den modell som presenteras här är lämplig för koagulering relaterade studier möjliggör analys av olika aspekter av koagulation och dess interaktion med EG. 8 i xenotransplantation forskning, det är ett användbart system att testa olika genetiskt modifierade svin ECs antikoagulerande egenskaper efter inkubation med humanblod 9.
De viktigaste stegen i protokollet finns de att säkerställa komplett cell täckning (konfluens) av mikrokulor i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av schweiziska National Science Foundation (SNSF, Grant No. 320030_156193). Författarna vill tacka Dr Benoît Werlen för att ge Biosilon microcarrier pärlor. Vi tackar också Prof. Hans Peter Kohler och Prof. André Haeberli för hjälp med att sätta upp microcarrier pärla modellen.
Materials
| PAEC | Isolated from pig aorta in our Lab | ||
| Microcarrier beads (Biosilon) | Thermo Fisher Scientific | 160-250 | |
| Collagen I, Bovine | Gibco | A10644-01 | |
| DMEM | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Sigma | M7528 | |
| RPMI | Gibco | 32404-014 | |
| Neutral tubes | Sarstedt | 02.1726.001 | |
| Polypropylene tubes | Simport | T406-2A | |
| Stirrer flasks | Tecnomara | ||
| Biological stirrer | Brouwer | MCS-104S | |
| Rat anti CD31 | R&D Systems | MAB33871 | Dilution 1:100 |
| Goat anti-rat IgG-Cy3 | Jackson Immuno Research | 112-166-003 | Dilution 1:500 |
| Goat anti VE-cadherin | Santa Cruz | sc-6458 | Dilution 1:100 |
| Rabbit anti vWF | DAKO | A0082 | Dilution 1:100 |
| Dk anti Gt IgG – Alexa 488 | Molecular Probes | A11055 | Dilution 1:500 |
| Goat anti Rabbit – FITC | Southern Biotech | 4050-02 | Dilution 1:500 |
| DAPI | Sigma | 32670-25MG-F | Dilution 1 µg/mL |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Concentration: 10% in cell culture medium |
| Needle | Becton Dickinson | 367286 | Size: 0.8×19 mm (21ɢ 3/4") |
| Adapter | Sarstedt | 14.1205 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 710 | |
| Image analysis software | Image J | Available for free at: https://imagej.net | |
| Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix | PromoCell | C-39216 | 2mL in 500mL of DMEM |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| Heparinun natricum | Drossa Pharm AG | Stock concentration: 5000 U.I./ mL | |
| Chamberslides | Bioswisstec AG | 30108 | |
| CaCl2 x 2H2O | Merck | 2382.0500 | |
| MgCl2 x6 H2O | Merck | 1.5833.1000 | |
| Tween 20 | Axon Lab AG | 9005-64-5 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Glycergel mounting medium | Dako | C0563 |
References
- Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).
- Rajwal, S., Richards, M., O’Meara, M. The use of recalcified citrated whole blood – a pragmatic approach for thromboelastography in children. Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).
- Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation. Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).
- Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro. J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).
- Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood. Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).
- Cowan, P. J., d’Apice, A. J. Complement activation and coagulation in xenotransplantation. Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).
- Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).
- Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces. Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).
- Bongoni, A. K., et al. Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions. Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).
- Miyazaki, Y., et al. High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles. Blood. 88, 3456-3464 (1996).
- Wuensch, A., et al. Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs. Transplantation. 97, 138-147 (2014).
