Wir zeigen eine Snap-Chip-Technologie für die Durchführung von cross-reactivity-freie gemultiplexten Sandwich Immunoassays durch Einrasten einfach zwei Folien. Ein Snap-Apparat dient zur Übertragung von zuverlässig Reagenzien von Microarray-Microarray. Die Snap-Chip kann für jede biochemischen Reaktionen erfordern NS1 der verschiedenen Reagenzien ohne Cross-Kontamination verwendet werden.
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Methodenartikel
Snap Chip für Cross-reactivity frei und Spotter Multiplex Sandwich Immunoassays
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Multiplex Protein-Analyse ergab höhere diagnostische Sensitivität und Genauigkeit im Vergleich zu einzelnen Proteine. AntikörperMicroarrays erlauben Tausende Mikromaßstab Immunoassays gleichzeitig auf einem einzigen Chip durchgeführt. Sandwich-Assay-Format Spezifität des Assays erkennt jedes Ziel mit zwei Antikörper verbessert, sondern Kreuzreaktivität zwischen Reagenzien, wodurch ihre multiplexing Fähigkeiten leidet. Antikörper NS1 Microarray (ACM) für cross-reactivity-freie gemultiplexten Proteindetektion entwickelt wurde, aber erfordert eine teure vor-Ort-Spotter für Microarray Herstellung während der Tests. In dieser Arbeit zeigen wir Ihnen eine Snap-Chip-Technologie, die Reagenz von Microarray-Microarray überträgt, indem einfach schnappen zwei Chips zusammen, somit kein Spotter während der Inkubation der Probe und Nachanmeldung Erkennung Antikörper (Tupfer) auf benötigt wird Lagerung von Pre-gefleckte Folien, Wehre die Folie Vorbereitung von Assay Ausführung. Sowohl Einzel- und Doppelzimmer Transfermethoden werden vorgestellt, um genaue Ausrichtung zwischen den beiden Microarrays zu erreichen und die Herstellung der Folie für beide Methoden werden beschrieben. Ergebnisse zeigen, dass < mit doppelten Transfer erreichen eine Array-Dichte von 625 Punkte/cm240 μm Ausrichtung erreicht wurde. Ein 50-Plexed-Immunoassay wurde durchgeführt, um die Nutzbarkeit des Snap-Chips in Multiplex Protein-Analyse zu demonstrieren. Nachweisgrenzen von 35 Proteine befinden sich in der Reichweite des Pg/mL.
Einleitung
Eine Jury bestehend aus mehreren Proteinen Biomarker können höhere Sensitivität und Spezifität als einen einzigen Biomarker in der Diagnostik von komplexen Krankheiten wie Krebs1,2. Die Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) wurde der Goldstandard Technik in klinischen Labors erreichen maximal Erkennung bei niedrigen Pg/mL im Plasma, aber Grenzen auf ein Ziel pro Assay3,4,5. AntikörperMicroarrays sind entwickelt worden, denn Platz für Tausende von miniaturisierten Assays parallel auf einem einzigen Mikroskop Fo....
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Protokoll
1. Herstellung und Lagerung von snap Chips
- einzelne Übertragungsmethode ( Abbildung 1a)
- Spot Kabine Lösungen enthält 400 µg/mL Antikörper und 20 % Glycerin in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf eine Nitrocellulose (oder einem funktionalisierten Glas) Assay-Folie mit einem Inkjet-Microarray Spotter 13 bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 % (1.2 nL für jeden Fleck) mit 800 µm-Mitte-zu-Mitte-Abstand. Sicherstellen, dass die Folie auf die Spotter-Deck nach einer Ecke fest (hier links unten verwendet wurde).
- Die gefleckte Assay-Folie bei Raumtemperatur 1 h mit einer relati....
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Ergebnisse
Das Testverfahren für Einzel- und Doppelzimmer Transfermethoden ist in Abbildung 1dargestellt. In einzelnen zu übertragen die Kabinen sind direkt auf der Folie Assay gesichtet und die Farbtupfer auf der Assay-Folie bei Verwendung in einem Spiegel-Muster der Kabinen (Abbildung 1a) übertragen. Nur ein Übertragungsverfahren ist erforderlich, aber diese Methode leidet Fluchtungsfehler zwischen den zwei Microarrays, hauptsächlich bedi.......
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Diskussion
In dieser Arbeit haben wir eine Snap-Chip-Technologie vorgestellt, die cross-reactivity-freie Multiplex-Immunoassays für die Forscher mit einfachen Versuchsaufbau weithin verfügbar macht. Anders als bei bestehenden AntikörperMicroarrays, benötigt keine Microarray-Spotter für Endnutzer. Sowohl Einzel-als auch Doppelzimmer Transfermethoden demonstriert, und doppelte Übertragung bietet überlegene Ausrichtung Genauigkeit bis zu ~ 40 μm bei 98 % Flecken, mit die größten Fehlausrichtung von 63 µm14. Ein.......
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Offenlegungen
McGill Universität hat einige Aspekte dieser Arbeit mit Huiyan Li und David Juncker als Erfinder eine Patentanmeldung eingereicht.
Danksagungen
Wir danken Dr. Rob Sladek für die Verwendung von Inkjet-Spotter. Wir anerkennen die letzte Unterstützung der kanadischen Institute für Gesundheit Forschung (CIHR), die Naturwissenschaft und Engineering Research Council of Canada (NSERC), die kanadische Krebs Gesellschaft Research Institute und Canada Foundation für Innovation (CFI). D.J. Dank Unterstützung von einem Canada Research Chair.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Phosphatgepufferte Kochsalztablette | Fisher Scientific | 5246501EA | |
| Streptavidin-konjugiert Cy5 | Rockland | s000-06 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | p1379 | |
| Rinderserumalbumin | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 001-000-162 | |
| Glycerin | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Blockierungslösung: BSA-freier Stabilisator Stabilisator Stabilisator | SurModics, Inc | SG02 | |
| Nitrozellulose-beschichtete Objektträger | Grace Bio-Laboratories, Inc | 305116 | |
| Aminosilan-beschichtete Objektträger | Schott Nordamerika | 1064875 | |
| Snap Device | Parallex BioAssays Inc. | PBA-SD01 | |
| Inkjet-Microarray-Spotter | GeSiM | Nanoplotter 2.0 | |
| Dichtung des Schiebemoduls | Grace Bio-Laboratories, Inc | 204862 | |
| Feuchtigkeitsstabilisierungsperlen | Parallex BioAssays Inc. | PBA-HU60 | |
| Array-Pro Analyzer Software | Medien Kybernetik | Version 4.5 | |
| Fluoreszenz-Microarray-Scanner | Agilent | SureScan Microarray-Scanner | |
| Biostatistik-Software | GraphPad Software | GraphPad Prism 6 | |
| Endoglin-Einfang Antikörper | R& D Systems | MAB10972 | |
| Endoglin-Proteinen | D Systems | 1097-DE | |
| Endoglin Nachweis Antikörper | F& Technik D Systems | BAF1097 | |
| IL-6a (siehe Tabelle 1) | F& D Systems | ||
| IL-6b (siehe Tabelle 1) | Invitrogen |
Referenzen
- Mor, G., et al. Serum protein markers for early detection of ovarian cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).
- Nicolini, A., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
