Mitochondriale Ca2 + retentie capaciteit Assay en Ca2 +-mitochondriale zwelling Assay geactiveerd

Summary

Dit protocol is gericht op het beschrijven van een methode om te onderzoeken of het Ca^{2 +} retentie capaciteit en Ca^{2 +}– geactiveerd mitochondriale zwelling van geïsoleerde mitochondria van SH-SY5Y cellen stapsgewijze.

Abstract

De productie van ATP door oxidatieve fosforylatie is de primaire functie van de mitochondriën. Mitochondriën in hogere eukaryoten ook deelnemen aan cytosolische Ca^{2 +} bufferen en de ATP productie in mitochondriale kan worden bemiddeld door intramitochondrial gratis Ca^{2 +} concentratie. CA^{2 +} retentie capaciteit kan worden beschouwd als het vermogen van de mitochondriën te behouden van calcium in de mitochondriale matrix. Geaccumuleerde intracellulaire Ca^{2 +} leidt tot de doorlaatbaarheid van de innerlijke mitochondriale membraan, genoemd de opening van mitochondriale permeabiliteit overgang porie (mPTP), die leidt tot het weglekken van moleculen met een moleculair gewicht van minder dan 1,5 kDa. CA^{2 +}-mitochondriën zwelling wordt gebruikt om aan te geven van de opening van de mPTP geactiveerd. Hier beschrijven we twee testen om te controleren de Ca^{2 +} retentie capaciteit en Ca^{2 +}-mitochondriale zwelling in geïsoleerde mitochondriën geactiveerd. Na bepaalde hoeveelheden van Ca^{2 +} worden toegevoegd, kunnen alle stappen worden voltooid in één dag en geregistreerd door een microplate-lezer. Dus, deze twee eenvoudige en effectieve testen kunnen worden vastgesteld om te beoordelen de Ca^{2 +}-mitochondriale functies.

Introduction

Mitochondriën zijn de belangrijkste cellulaire organen te produceren bijna 95% van de ATP in de cellen van zoogdieren gebruikt door oxidatieve fosforylering. Het is gemeld dat de afgezonderd micromolar concentratie van Ca^{2 +} door de mitochondriën, de aanwezigheid van ADP en anorganisch fosfaat kan worden gebruikt om phosphorylate ADP op¹ATP synthese. Wanneer de concentratie van cytosolische Ca^{2 +} boven een drempel gaat, mitochondriën kunnen opname Ca^{2 +} snel en efflux het langzaam. Zo kunnen de functionerende mitochondriën toestroom de verhoogde cytosolische Ca^{2 +}. Irrelevant voor de deelname aan de oxidatieve fosforylatie, de mitochondriale Ca^{2 +} ook deelnemen aan de cytosolische calcium-signalen en het mechanisme van de mitochondriale apoptotic activeren door de opening van de mPTP in de binnenste mitochondriale inducerende membraan². Het is algemeen erkend dat een abnormale verhoging van de intracellulaire Ca^{2 +} mitochondriale enorme zwelling veroorzaken kan door het openen van de mPTP-³. Dus, dit protocol heeft tot doel te beoordelen van de mitochondriale functie door het kwantificeren van de mitochondriale Ca^{2 +} retentie capaciteit en Ca^{2 +}-trigged mitochondriale zwelling.

CA^{2 +} retentie capaciteit is de meting van het vermogen van de mitochondriën om opname cytosolische calcium. Mitochondriën kunnen buffer het cytosolische vrij calcium en calcium-afhankelijke cellulaire processen regelen door opname van de calcium in de vorm van inactieve precipitaten. Verminderde Ca^{2 +} retentie capaciteit treedt op in stress verschijnselen die is gekoppeld aan de beperking van de energie en zelfs neurodegeneratieve ziekten^4,5. Geïsoleerde mitochondriën of digitonin-permeabel cellen kunnen worden gebruikt voor identificatie van de Ca^{2 +} retentie capaciteit, en de verhoogde capaciteit om te accumuleren Ca^{2 +} door geïsoleerde mitochondriën met de additonal glutamaat en malate wordt niet verricht door de mitochondriale isolatie procedure⁶. Een bepaalde hoeveelheid digitonin moet worden gebruikt om de permeabilize van de plasma-membranen van verschillende celtypes. Het hexapotassium zout van Ca^{2 +}-bindende groen fluorescente kleurstof, een Ca^{2 +}-gevoelige cel-impermeant zichtbaar licht-prikkelbaar indicator, gebruikte⁷is geweest. CA^{2 +}-bindende groen fluorescente kleurstof is een indicator van de lage-affiniteit en gebruikt om te tonen dat intracellulaire gratis Ca^{2 +} concentraties stijgen blijven tijdens langdurige (5 min) stimulaties⁸. Deze methode is minder gevoelig dan de radioactieve filter techniek maar werd sterk vereenvoudigd. De extra Ca^{2 +} calcium groene fluorescentie verheft en de Ca^{2 +} ICT door mitochondriën retourneert de fluorescentie op basislijn. Opeenvolgende toevoegingen van Ca^{2 +} aangebracht totdat de mitochondriën niet opname extramitochondrial Ca^{2 + 9}. Een fluorescentie microplate lezer kan worden gebruikt om voortdurend verslag de calcium groene fluorescentie.

Na Ca^{2 +} accumulatie, mitochondriën depolarized, vrijgegeven Ca^{2 +} in het medium, en begon te zwellen. CA^{2 +}-mitochondriën zwelling wordt gebruikt om aan te geven van de opening van de mPTP geactiveerd. Elektronenmicroscopie en de daling lichtabsorptie bij 540 nm kan worden gebruikt voor het meten van de Ca^{2 +}-geactiveerd mitochondriale zwelling^10,11. Volume van de mitochondriën kan rechtstreeks worden bepaald door de voorwaartse hoek lichtverstrooiing¹², waar de dalingen van de extinctie passieve zwelling van de mitochondriale matrix reflecteren.

Hier, we illustreren de methodologie te onderzoeken van de mitochondriale Ca^{2 +} retentie capaciteit en Ca^{2 +}-mitochondriale zwelling in geïsoleerde mitochondriën van de cellen van de SH-SY5Y geactiveerd.

Protocol

1. isolatie van Mitochondria Opmerking: Alle oplossingen en apparatuur moeten worden precooled op 0 – 4 ° C en op ijs. Zaad ongeveer 3 x 106 SH-SY5Y cellen per 10 cm cel cultuur schotel. Cultuur cellen in hoge-glucose Dulbecco gewijzigd van Eagle medium met 10% foetale runderserum, penicilline (100 U/mL)-streptomycine (100 µg/mL). Handhaven bij 37 ° C in een broedstoof met 5% CO2 ‘s nachts.Opmerking: ten minste 1-2 x 107 SH-SY5Y cellen zijn nod…

Representative Results

De resultaten van de vertegenwoordiger van Ca2 + retentie capaciteit:Resultaten werden uitgedrukt als fluorescentie waarden. Met de extra pulsen van Ca2 + (200 nmols/mg mitochondriale eiwit), de fluorescentie stegen met dubbele boven basislijn met de opening van de mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), een inhibitor van de omwenteling van Ca2 +-geïnduceerde mPTP opening, of 1 μM atractyloside (ATR), een activator van Ca2 +-geïnduceerde …

Discussion

Hier, beschreven we een eenvoudige en effectieve protocol voor de mitochondriale Ca^{2 +} retentie capaciteit assay en Ca^{2 +}-mitochondriale zwelling assay geactiveerd.

Voor de mitochondriale isolatie, door ervoor te zorgen dat alle materialen en buizen op ijs, zijn met name wanneer de cellen homogenisatie. 0,25% trypsine-EDTA kan ook worden gebruikt om het loskoppelen van de cellen van de schotel voor 5 minuten bij 37 ° C. Na 15 tot 25 lijnen is het noodzakelijk om te obser…

Materials

SH-SY5Y cell line	ATCC (The Global Bioresource Center)	ATCC Number: CRL-2266
Calcium green-5N	Life Technologies	c-3737	Ca2+-binding green fluorescent dye
complete protease inhibitors	Roche Molecular Biochemicals	4693116001
glass homogenizer	Kimble Chase	9885303002
glutamate	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
malate	Sigma-Aldrich	46940-U
rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	00457
K2HPO4	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2	Sigma-Aldrich	V900266
Varioskan flash instruments	Thermo Scientific	IC100E
Bongkrekate	Biovision	1820-100
atractyloside	Sigma-Aldrich	C4992
high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium	Hyclone	SH30022	4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate
fetal bovine serum	Hyclone	SV30087
penicillin	Sigma-Aldrich	P3032
streptomycin	Invitrogen	11860-038
BCA assay kit	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
10 cm cell culture dish	NEST	704001