Mitokondrielt Ca2 + oppbevaring kapasitet analysen og Ca2 +-utløst mitokondrie hevelse analysen

Summary

Denne protokollen skal beskriver en metode for å undersøke Ca^{2 +} varmekapasitet og Ca^{2 +}– utløst mitokondrie hevelse i isolerte mitokondrier av SH-SY5Y celler trinnvis.

Abstract

Produksjon av ATP ved oxidative fosforylering er den primære funksjonen av mitokondrier. Mitokondrier i høyere eukaryoter også delta i cytosolic Ca^{2 +} bufring og ATP produksjonen i mitokondrie kan være formidlet av intramitochondrial gratis Ca^{2 +} konsentrasjon. Ca^{2 +} oppbevaring kapasitet kan betraktes som evnen til mitokondrier beholde kalsium i mitokondrie matrisen. Akkumulert intracellulær Ca^{2 +} fører til permeabilitet av interne mitokondrie membran, kalt åpningen av mitokondrie permeabiliteten overgangen pore (mPTP), noe som fører til lekkasje av molekyler med en molekylær vekt mindre enn 1,5 kDa. Ca^{2 +}-utløst mitokondrier hevelse brukes til å angi mPTP åpningen. Her beskriver vi to analyser for å undersøke Ca^{2 +} varmekapasitet og Ca^{2 +}-utløst mitokondrie hevelse i isolerte mitokondrier. Etter visse mengder av Ca^{2 +} er lagt, kan alle trinnene fullført i en dag og registrert av en microplate-leser. Dermed disse to enkle og effektive analyser kan bli vedtatt for å vurdere Ca^{2 +}-relaterte mitokondrie funksjoner.

Introduction

Mitokondrier er de viktigste cellulære organene å produsere nesten 95% av ATP brukes i pattedyrceller av oxidative fosforylering. Det er rapportert at sequestered micromolar konsentrasjonen av Ca^{2 +} av mitokondrier, ADP, og uorganiske fosfat kan brukes til å phosphorylate ADP syntese ATP¹. Når konsentrasjonen av cytosolic Ca^{2 +} går over en viss grense, mitokondrier kan uptake Ca^{2 +} raskt og middelklasseinnbyggere det sakte. Dermed kan fungerende mitokondrier tilstrømningen av økt cytosolic Ca^{2 +}. Irrelevant for deltakelse i oxidative fosforylering, den mitokondrie Ca^{2 +} også ta del i cytosolic kalsium signaler og aktivere mitokondrie apoptotisk mekanismen av inducing åpningen av mPTP i indre mitokondrie membran². Det har vært anerkjent at unormal rettighetsutvidelse intracellulær Ca^{2 +} kan indusere mitokondrie massiv hevelse ved å åpne mPTP³. Derfor denne protokollen skal vurdere funksjonen mitokondrie av kvantifisere mitokondrie Ca^{2 +} oppbevaring kapasitet og Ca^{2 +}-trigged mitokondrie hevelse.

Ca^{2 +} oppbevaring kapasitet er måling av evnen til mitokondrier til opptak cytosolic kalsium. Mitokondrier kan bufre cytosolic gratis kalsium og regulere kalsium-avhengige mobilnettet prosesser av kalsium opptak i form av inaktive precipitates. Nedsatt Ca^{2 +} varmekapasitet oppstår i stress fenomener forbundet med energi begrensning og selv nevrodegenerative sykdommer^4,5. Isolert mitokondrier eller digitonin-permeabilized celler kan brukes til å identifisere Ca^{2 +} oppbevaring kapasitet og forhøyet muligheten til å samle Ca^{2 +} av isolerte mitokondrier med ytterligere glutamat og malate påvirkes ikke av de Mitokondrielt isolasjon prosedyren⁶. En titrerte mengde digitonin skal brukes til å permeabilize plasma membraner av forskjellige celletyper. Hexapotassium salt av Ca^{2 +}-bindende grønne fluorescerende farge, en Ca^{2 +}-sensitive celle-impermeant synlig lys-nervøs indikator, har vært mye brukt⁷. Ca^{2 +}-bindende grønn fluorescerende fargestoff er en lav-affinitet indikator og brukes til å vise at intracellulær gratis Ca^{2 +} konsentrasjoner fortsetter å stige under langvarig (5 min) stimulations⁸. Denne metoden ble mindre sensitive enn radioaktivt filter teknikken, men ble sterkt forenklet. Den ekstra Ca^{2 +} løfter kalsium grønne fluorescens og Ca^{2 +} opptaket av mitokondrier returnerer fluorescensen som opprinnelig plan. Sekvensielle filer av Ca^{2 +} ble gjort til mitokondrier kunne opptak extramitochondrial Ca^{2 + 9}. En fluorescens microplate leser kan brukes kontinuerlig rapportere kalsium grønne fluorescens.

Etter Ca^{2 +} opphopning, mitokondrier depolarized, utgitt Ca^{2 +} til medium, og begynte å svelle. Ca^{2 +}-utløst mitokondrier hevelse brukes til å angi mPTP åpningen. Elektronmikroskop og nedgangen i lys absorbans ved 540 nm kan brukes til å måle Ca^{2 +}-utløst mitokondrie hevelse^10,11. Mitokondrier volum kan direkte bestemmes av fremover vinkel lysspredning¹², der nedgang i absorbansen gjenspeiler passiv hevelse i mitokondrie matrix.

Her vi illustrere metodikk for å undersøke mitokondrie Ca^{2 +} oppbevaring kapasitet og Ca^{2 +}-utløst mitokondrie hevelse i isolerte mitokondrier fra SH-SY5Y celler.

Protocol

1. isolering av mitokondrier Merk: Alle løsninger og utstyr skal være forkjøles og lagres til 0 – 4 ° C og holdt på is. Frø ca 3 x 106 SH-SY5Y celler per 10 cm celle kultur parabol. Kultur celler i høy-glukose Dulbecco modifiserte Eagle medium med 10% fosterets bovin serum, penicillin (100 U/mL)-streptomycin (100 µg/mL). Opprettholde på 37 ° C i en inkubator inneholder 5% CO2 over natten.Merk: minst 1-2 x 107 SH-SY5Y celler kreves for hv…

Representative Results

Representant resultatene av Ca2 + oppbevaring kapasitet:Resultatene ble uttrykt som fluorescens verdier. Med de ekstra pulser av Ca2 + (200 nmols/mg mitokondrie protein), fluorescens økte med dobbel over grunnlinjen med mPTP åpningen. 5 μM Bongkrekate (BKA), en inhibitor av Ca2 +-indusert mPTP åpning eller 1 μM atractyloside (ATR), en aktivator av Ca2 +-indusert mPTP åpning, ble lagt til i isolerte mitokondrier. Mengden totalt…

Discussion

Her vi beskrev en enkel og effektiv protokoll for mitokondrie Ca^{2 +} oppbevaring kapasitet analysen og Ca^{2 +}-utløst mitokondrie hevelse analysen.

For mitokondrie isolasjon, sikre at alle materialer og rør er på is, spesielt når homogenisere cellene. 0.25% trypsin-EDTA kan også brukes til å koble celler fra parabolen for 5 min på 37 ° C. Etter 15-25 slag er det nødvendig å observere intakt cellemembranen under mikroskopet og unngå brudd på mitokondrier membranen…

Materials

SH-SY5Y cell line	ATCC (The Global Bioresource Center)	ATCC Number: CRL-2266
Calcium green-5N	Life Technologies	c-3737	Ca2+-binding green fluorescent dye
complete protease inhibitors	Roche Molecular Biochemicals	4693116001
glass homogenizer	Kimble Chase	9885303002
glutamate	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
malate	Sigma-Aldrich	46940-U
rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	00457
K2HPO4	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2	Sigma-Aldrich	V900266
Varioskan flash instruments	Thermo Scientific	IC100E
Bongkrekate	Biovision	1820-100
atractyloside	Sigma-Aldrich	C4992
high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium	Hyclone	SH30022	4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate
fetal bovine serum	Hyclone	SV30087
penicillin	Sigma-Aldrich	P3032
streptomycin	Invitrogen	11860-038
BCA assay kit	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
10 cm cell culture dish	NEST	704001