Mitokondriell Ca2 + Retention kapacitet Assay och Ca2 +-utlöst mitokondriell svullnad Assay

Summary

Detta protokoll syftar till att beskriva en metod för att undersöka Ca^{2 +} retention kapacitet och Ca^{2 +}– utlöst mitokondriell svullnad av isolerade mitokondrier av SH-SY5Y celler steg för steg.

Abstract

Produktionen av ATP genom oxidativ fosforylering är den primära funktionen av mitokondrier. Mitokondrier i högre eukaryotes också delta i cytosoliskt Ca^{2 +} buffring och ATP produktionen i mitokondriell kan medlas av intramitochondrial gratis Ca^{2 +} koncentration. Ca^{2 +} retention kapacitet kan betraktas som förmåga att mitokondrierna att behålla kalcium i matrisen mitokondrie. Ackumulerade intracellulära Ca^{2 +} leder till permeabiliteten i det inre mitokondriella membranet, kallas öppnandet av mitokondriell permeabilitet övergången pore (mPTP), vilket leder till läckage av molekyler med en molekylär vikt mindre än 1,5 kDa. Ca^{2 +}-utlöst mitokondrier svullnad används för att indikera mPTP öppningen. Här beskriver vi två analyser för att undersöka Ca^{2 +} retention kapacitet och Ca^{2 +}-utlöst mitokondriell svullnad i isolerade mitokondrier. Efter vissa mängder av Ca^{2 +} läggs, kan alla steg vara klar på en dag och inspelad av en microplate reader. Således dessa två enkla och effektiva testmetoder kan antas för att bedöma den Ca^{2 +}-mitokondriella funktioner.

Introduction

Mitokondrierna är de viktigaste cellulära organen att producera nästan 95% av ATP används i däggdjursceller av oxidativ fosforylering. Det rapporteras att den beslagtagna mikromolära koncentrationen av Ca^{2 +} av mitokondrier, förekomsten av ADP och oorganiskt fosfat kan användas att fosforylera ADP till syntes ATP¹. När koncentrationen av cytosoliska Ca^{2 +} går över en tröskel, mitokondrier kan upptag Ca^{2 +} snabbt och efflux det långsamt. Således, fungerande mitokondrier kan inflödet av ökad cytosoliska Ca^{2 +}. Irrelevant för deltagande i den oxidativ fosforyleringen, den mitokondriella Ca^{2 +} också delta i de cytosoliska kalcium signalerna och aktivera mitokondriell apoptotiska mekanismen genom att inducera öppnandet av mPTP i inre mitokondrie membranet². Det har varit allmänt kända att onormal höjning av intracellulära Ca^{2 +} kan inducera mitokondriell massiva svullnad genom att öppna den mPTP³. Detta protokoll syftar således, att bedöma mitokondriefunktion genom kvantifiera mitokondriell Ca^{2 +} retention kapacitet och Ca^{2 +}-utlöst mitokondriell svullnad.

Ca^{2 +} retention kapacitet är mätning av mitokondrier förmåga att upptag cytosoliska kalcium. Mitokondrier kan buffra de cytosoliska fritt kalciumet och reglera kalcium-beroende cellulära processer av kalcium upptag i form av inaktiva fällningar. Nedsatt Ca^{2 +} retention kapacitet uppstår i stress fenomen förknippade med energi begränsning och även neurodegenerativa sjukdomar^4,5. Isolerade mitokondrier eller digitonin-permeabilized celler kan användas för att identifiera Ca^{2 +} retention kapacitet, och den förhöjda förmågan att ackumulera Ca^{2 +} isolerade mitokondrien med tilläggsupplysningar glutamat och malate sker inte genom den mitokondriell isolering förfarande⁶. En titrerad mängd digitonin bör användas för att permeabilize plasma membran av olika celltyper. Hexapotassium salt Ca^{2 +}-bindande grön fluorescerande färgämne, en Ca^{2 +}-känsliga cell-impermeant synligt ljus-retbara indikator, har varit utbredda⁷. Ca^{2 +}-bindande grön fluorescerande färgämne är en indikator på låg affinitet och används för att visa att intracellulära gratis Ca^{2 +} koncentrationer fortsätter att stiga under långvarig (5 min) stimuli⁸. Denna metod var mindre känslig än den radioaktiva filter tekniken men var kraftigt förenklad. Den ytterligare Ca^{2 +} höjer kalcium grön fluorescens och Ca^{2 +} upptaget av mitokondrier returnerar fluorescensen till baslinjen. Sekventiell tillägg av Ca^{2 +} gjordes tills mitokondrierna underlåtit att upptag extramitochondrial Ca^{2 + 9}. En fluorescens microplate reader kan användas kontinuerligt rapportera kalcium gröna fluorescensen.

Efter Ca^{2 +} ackumulation, mitokondrierna Aricebo släppt Ca^{2 +} till medium och började svälla. Ca^{2 +}-utlöst mitokondrier svullnad används för att indikera mPTP öppningen. Elektronmikroskopi och minskningen av ljusabsorbans vid 540 nm kan användas för att mäta den Ca^{2 +}-utlöst mitokondriell svullnad^10,11. Mitokondrier volym kan bestämmas direkt genom framåt vinkel ljusspridning¹², där minskningar av absorbansen återspeglar passiva svullnad av mitokondriell matrisen.

Här, vi illustrera metoden för att undersöka mitokondriell Ca^{2 +} retention kapacitet och Ca^{2 +}-utlöst mitokondriell svullnad i isolerade mitokondrier från SH-SY5Y celler.

Protocol

1. isolering av mitokondrier Obs: Alla lösningar och utrustning bör vara förhandskyld till 0 – 4 ° C och hållas på is. Utsäde ca 3 x 106 SH-SY5Y celler per 10 cm cell kultur maträtt. Kultur celler i hög-glukos Dulbecco ändrade Eagle medium med 10% fetalt bovint serum, penicillin (100 U/mL)-streptomycin (100 µg/mL). Underhåll vid 37 ° C i en inkubator som innehåller 5% CO2 över natten.Obs: minst 1-2 x 107 SH-SY5Y celler behövs för …

Representative Results

Representativa resultat av Ca2 + Retention kapacitet:Resultaten uttrycktes som fluorescens värden. Med ytterligare pulser av Ca2 + (200 nmols/mg mitokondriell protein), fluorescensen ökade med dubbel över baslinjen med mPTP öppningen. 5 μM Bongkrekate (BKA), en hämmare av Ca2 +-inducerad mPTP öppning, eller 1 μM atractyloside (ATR), en aktivator av Ca2 +-inducerad mPTP öppning, lades i isolerade mitokondrier. Mängden total…

Discussion

Här, vi beskrivs ett enkelt och effektivt protokoll för mitokondriell Ca^{2 +} retention kapacitet test och Ca^{2 +}-utlöst mitokondriell svullnad assay.

För mitokondriell isolering, se till att alla material och rör är på is, särskilt när homogenisering cellerna. 0,25% trypsin-EDTA kan också användas för att lossa cellerna från skålen för 5 min vid 37 ° C. Efter 15-25 linjer är det nödvändigt att iaktta intakt cellmembranet under mikroskopet och undvika brot…

Materials

SH-SY5Y cell line	ATCC (The Global Bioresource Center)	ATCC Number: CRL-2266
Calcium green-5N	Life Technologies	c-3737	Ca2+-binding green fluorescent dye
complete protease inhibitors	Roche Molecular Biochemicals	4693116001
glass homogenizer	Kimble Chase	9885303002
glutamate	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
malate	Sigma-Aldrich	46940-U
rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	00457
K2HPO4	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2	Sigma-Aldrich	V900266
Varioskan flash instruments	Thermo Scientific	IC100E
Bongkrekate	Biovision	1820-100
atractyloside	Sigma-Aldrich	C4992
high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium	Hyclone	SH30022	4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate
fetal bovine serum	Hyclone	SV30087
penicillin	Sigma-Aldrich	P3032
streptomycin	Invitrogen	11860-038
BCA assay kit	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
10 cm cell culture dish	NEST	704001