在本协议中, 荧光标记为T. 虫被注射到透明的斑马鱼幼虫中, 并使用光片荧光显微镜观察到体内的寄生虫运动。
恰加斯病是由锥虫引起的寄生虫感染, 其运动不仅对局部化很重要, 而且对细胞的结合和侵袭也是如此。当前动物模型为研究T. 虫允许有限的观察寄生生物在体内,代表对了解寄生虫行为的挑战在最初的阶段在人的传染。这种原生动物在载体和哺乳动物宿主中都有一个鞭毛阶段, 但是没有研究描述它的运动在体内。该项目的目的是建立一个活脊椎动物斑马鱼模型, 以评估T. 虫运动的血管系统。透明斑马鱼幼虫注射荧光标记 trypomastigotes 和观察使用光片荧光显微镜 (LSFM), 一种无创的方法, 可视化活生物体高光学分辨率。由于这种技术相对于共焦或荧光显微镜的光风险较低, 寄生虫可以被可视化较长时间。T. 虫寄生虫在不同血管和蛋黄的活斑马鱼循环系统中观察到。他们也可以看到连接到卵黄囊壁和房室瓣, 尽管强烈的力量与心脏收缩有关。LSFM 的T. 虫-接种斑马鱼幼虫是一种有价值的方法, 可用于可视化循环寄生虫和评价其取向, 迁移模式, 并在动态环境中的活动动物心血管系统的运动。
恰加斯病是由原生动物寄生虫引起的T. 虫.全世界大约有6至700万人感染了T. 虫。这种疾病主要在拉丁美洲传播, 但在美国、加拿大和许多欧洲以及一些西太平洋国家都有报道, 主要是由于受感染的个人的迁徙1。恰加斯在很大程度上是通过与 Triatominae 亚科的 hematophagic 昆虫的粪便接触而传染给人类的, 俗称 “接吻虫”。但是, T. 虫也可以通过输血、从母亲到儿童的垂直转移或摄入受寄生虫感染的食物 (2) 进行传输。急性阶段的感染主要是无症状或组成症状和持续时间从6到8周, 在此之后, 免疫系统的参与控制寄生虫负荷, 但没有完全消除感染3。多数个体然后进入慢性无症状的阶段;然而, 近30% 的患者发展为症状性慢性期, 其中心脏系统和较少频繁消化系统和神经系统被危及4。这种情况对疾病的治疗和控制提出了挑战, 因为没有疫苗可供使用, 而且只有两种有效药物用于恰加斯: 唑和呋。这两种治疗方法都需要长时间的管理, 并且可能有严重的副作用2。
提高对T. 虫行为在体内的行为的理解是确定寄生迁移、细胞附着和宿主内部入侵的关键;缺乏在体内模型限制了新的治疗方法的发展。体外对T. 虫感染的研究表明, trypomastigotes 的运动对宿主细胞膜和随后的细胞侵袭5具有重要作用。trypomastigotes 中的能量消耗在与易感细胞系共培养中被证明可以减少细胞侵入6。有趣的是, 在 trypanosomatids, 鞭毛运动也被定性为一种规避寄生虫特异抗体的机制7。
鞭毛运动已被广泛研究在体外在锥布, 一个密切相关的寄生虫, 导致非洲锥虫病8。体外对这些锥的运动的研究表明, 模拟的血液或体液的条件, 包括粘度和存在的障碍代表血细胞, 是重要的寄生虫向前运动9.到目前为止, 还无法将寄生虫在血液中的运动在体内进行可视化。
斑马鱼幼虫是研究宿主-病原体相互作用的一个强有力的模型在体内。与其他已建立的恰加斯病的脊椎动物模型相比, 它们体积小, 价格低廉, 而且相对容易饲养。斑马鱼的先天和适应性免疫系统类似于人类, 但他们的适应性免疫系统开始发展4天后受精 (dpf), 并没有成熟的另一个几个星期10。在早期的发展过程中, 当只有巨噬细胞存在时, 有一个很大的窗口来研究寄生虫的行为, 而没有立即的免疫干扰10。然而, 利用斑马鱼幼虫作为研究病原体行为的脊椎动物模型的最大优势在于它们的光学透明度, 使它们适于显微镜检查和成像11。此外, 有多种工具来操纵鱼类遗传学。例如, “精灵” 菌株是斑马鱼的变种, 没有色素沉着, 使动物完全透明和有用的可视化的个别器官和 real-time 跟踪注入细胞12。
利用共焦或荧光显微镜观察活斑马鱼快速移动寄生虫的纵向观测的一个关键限制在于, 在高采集速度和大穿透深度下, 成像质量和低光的风险。光表荧光 micsroscopy (LSFM) 是一种新兴的成像技术, 克服这些限制, 允许这些观察。利用一个目标检测荧光和第二个正交光照目标, 只照亮检测目标的焦面, 就可以在共焦显微镜下获得高分辨光学截面, 但显着减少光, 甚至关于荧光显微镜13。这里使用的 LSFM 技术称为单平面照明显微镜 (SPIM), 其中一层薄薄的光照亮了斑马鱼幼虫中的一张飞机。
该方法的目的是建立斑马鱼幼虫作为一个可行的感染模型, 以了解T. 虫运动和相关行为在体内。为了做到这一点, 我们注射了透明的斑马鱼幼虫与荧光标记 trypomastigotes, 细胞形式负责感染人类, 并确定了运动的T. 虫在心血管循环的斑马鱼使用 LSFM。
本研究着重介绍了斑马鱼作为一种动物模型来研究病原体行为的优点在体内。特别是, 本研究提出了一种在其自然环境中对病原体虫进行可视化的方法: 血循环。鱼类的循环系统环境与哺乳动物相似, trypanosomatids 已经进化出了旅行的机制, 躲避免疫系统, 并在该环境中附加到感染细胞的25。本协议提供了一个关于在人类细胞系中培养T. 虫的最佳过程的描述, 并随后对荧光标记的鞭毛形式进行隔离。它然后显示适当的设置为成功地注射寄生虫入透明斑马鱼为以后装载和形象化使用 LSFM。最后, 本协议为有效和有效的在体内成像的寄生虫的位置和流通使用 LSFM。
锥的鞭毛从它的后部区域涌现, 从细胞身体流动, 并且在有机体的前面自由垂悬在26。T. 虫通过在身体前方挥舞鞭毛来推动自身, 这波动了寄生虫的整个身体。鞭毛运动不仅是不可缺少的寄生虫运动, 如在T. 布27 (非洲锥虫病的致病剂), 但它也被用于细胞感染, 正如已经在T. 虫5 中演示的那样. ,28。虽然斑马鱼不是T. 虫的天然宿主, 但使用此处所述的协议, 可以在发展中的心血管循环系统中研究寄生虫的运动。此外, 还有锥种感染科类的斑马鱼, 如t. carassii和t. borreli25.这些寄生虫种类可用于实时研究这些 trypanosomatids 的运动和附着机制;这样的研究可以洞察哺乳动物细胞感染过程。
在这项研究中, 注入运动的T. 虫寄生虫被观察到通过接种鱼的心血管循环, 移动与不透明的红细胞, 并坚持在心血管系统壁的结构。我们使用了一个国产 LSFM 与10X 无色长工作距离空气目标 (17.6 毫米) 为照明臂与数字孔径0.25。一个40X 的物镜水浸泡物镜的数值孔径为 0.8, 工作距离为3.5 毫米, 用于检测臂。检测目标被浸入样品室, 而光照目标则在腔室外。如洛伦佐et al.中所描述的, 室内的一个端口用片和光学胶水密封, 使照明光束进入腔室。18为了照明, 我们在 488 nm 使用了50兆瓦的 DPSS 激光器, 其功率由声光可调谐滤波器调制。检测路径采用与绿色荧光蛋白 (GFP) 或 FITC 相容的过滤器。配有毛细管取样器 (理想情况下具有自动旋转) 的光板显微镜和样品室的温度控制应该适合这个应用。如有必要, 应根据制造商的说明书或用户的实验室标准协议对显微镜进行校准和标定。在本协议中, 我们使用 SPIM 软件19控制了显微镜。
重要的是要注意, 在斑马鱼的循环, 幼虫寄生附着是有效的。在大是大非的静脉, 寄生虫仍然连着长达几分钟;在心脏, 他们举行了阀门和墙壁, 摆动与心脏收缩。进一步的研究仍然是为了阐明T. 虫是否与流向血液流动方向的流动红细胞相互作用。以前的体外研究表明, 固体结构 (如: 即, 血细胞) 的存在, 或增加液体的粘度以模拟血液的体外, 对寄生虫的运动和速度有显著的影响。9。
有许多问题关于感染的过程中的T. 虫在人类无逃逸吞噬细胞后, 最初受感染的细胞类型29。例如, 他们如何到达他们的目标器官?什么是倾向于首选器官的机制, 如心脏、消化系统和中枢神经系统?有趣的是, 在这项研究中, 寄生虫最初是在心脏成像的, 因为它是寄生生物密度最高的部位。然而, CFSE 信号随后在开发的肚腑积累了7天后注射。虽然鱼类和哺乳动物的解剖是不同的, 这项研究的结果表明了一种取向的形式, 因为它被观察到, 寄生虫表现出倾向于已知的首选靶器官, 尽管个体的差异。这项研究的一个重要限制是有关实验中使用的温度。斑马鱼幼虫在整个过程中应保持在 28 °C 左右。虽然这种温度可能类似于向量寄主 (Triatominae 亚科的昆虫), 但它与组成最终寄主的 warm-blooded 哺乳动物 (大约37° c) 是完全不同的。T. 虫已知在两个主机上都有鞭毛的生存形式;然而, 重要的是要牢记, 这一因素可能会影响动物的行为在体内。
虽然 fish´s 自适应免疫系统是不成熟的, 直到4周后受精, 先天免疫系统是活跃的早期开发10。早在48或 96 hpf, 吞噬细胞被发现吞噬标记锥 (数据没有显示)。这就限制了寄生虫可视化的时间窗口。然而, 如果一项研究的重点是评估 fish´s 免疫反应, 注射在后期阶段可能会被推荐。此外, 将寄生虫注入带有标记的巨噬细胞或免疫系统的其他单元的转基因鱼系, 可有助于研究寄生虫附着和可能的吞机制。重要的是要注意, 如果寄生虫被标记为 CFSE, 转基因细胞标签不应该是 GFP, 并在黄色或红色的光谱结束的标志是必需的。
为了评估寄生虫运动的详细方向, 在3维 (3D) 中跟踪它们的轨迹可能是有用的。对于3D 的可视化和重建过程, 需要一个高速系统。在该协议中使用的设备, 只有在一个平面上可视化寄生虫。在这种情况下, 我们优先考虑在寄生虫运动期间保持焦平面的稳定性, 并在一个平面上记录它的轨迹。
本文提出的方法为进一步研究心血管循环中的寄生虫行为铺平了道路。总之, 在斑马鱼幼虫体内成像活体荧光寄生虫的基本步骤是:(i) 使用早期孵化的胚胎 (24-48 hpf) 或幼虫, 或 72-96 hpf 之间的动物, 无色素沉着, 使其透明且易于注射;(ii) 在注射后应尽快将影像幼虫清除, 以避免吞噬细胞的寄生虫;(iii) 将 LSFM 集中在感兴趣的地点 (例如, 心包区) 并保持焦点。这个新的程序允许在一个环境中的 trypomastigotes 的可视化与它的自然感染生态位, 第一次提供的可能性, 研究T. 虫在一个活生生的有机体。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了Convocatoria Interfacultades的支持, 这些信息来自于Vicerrectoría de 门多萨市大学和美国国际开发署研究与创新奖学金计划。我们感谢布伊特拉戈和 Yeferzon 阿迪拉鱼的维护和援助。
0.5-10 μL Micropipette | Fisherbrand | 21-377-815 | |
Agarose RA | Amresco | N605 | Regular |
Agarose SFR | Amresco | J234 | Low Melting point |
Aquarium salt | Instant ocean | SS15-10 | |
Cell Count chamber | Boeco | Neubauer | |
Cell culture flasks | Corning | 430639 | |
Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
CFSE | ThermoFisher | C34554 | |
Detection objective | Nikon 40x 0.8NA | 40x CFI APO NIR | |
DMEM medium | Sigma-Aldrich | D5648 | |
Dumont #5 fine forceps | World precision Instruments | ||
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
Fetal calf serum (FCS) | Eurobio | CVFSVF00-01 | |
Filter | Chroma | ET-525/50M | |
Glass capillaries for embryo mounting | Vitrez Medical | 160215 | |
Glass capillaries for pulling needles | World precision instruments | TW100-4 | |
Glucose | Gibco | A2494001 | |
HEPES | Gibco | 156300-80 | |
Incubator | Thermo Corporation | Revco | |
Larval microinjection mold | Adaptive Science Tools | I-34 | |
Laser | Crystalaser | DL488-050 | |
L-glutamine | Gibco | 250300-81 | |
Methylene blue | Albor Químicos | 12223 | |
Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
Micromanipulator system | Sutter Instrument | MP-200 | For LSFM |
Micropipette puller device | Narishige | PC-10 | |
Microscope | Olympus | CX31 | |
Microscope (inverted) | Olympus | CKX41 | |
Multipurpose microscope | Nikon | AZ100M | |
Neubauer counting chamber | Boeco Germany | ||
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-163 | |
Petri dish 94×16 | Greiner bio-one | 633181 | |
Plastic pasteur pipette | Fisherbrand | 11577722 | |
Rotation stage | Newport | CONEX-PR50CC | |
RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R4130 | |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
Stereoscope | Nikon | C-LEDS | |
Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | |
TRIS | Amresco | M151 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | R-001-100 | |
Tubes 15 ml | Corning | 05-527-90 |