I denne protokollen, fluorescently merket T. cruzi ble injisert i gjennomsiktig sebrafisk larver og parasitten motilitet ble observert i vivo bruker lys ark fluorescens mikroskopi.
Chagas sykdom er en parasittisk infeksjon forårsaket av Trypanosoma cruzi, som motilitet ikke er bare viktig for lokalisering, men også for mobilnettet bindende og invasjon. Gjeldende dyremodeller for studier av T. cruzi tillate begrenset observasjon av parasitter i vivo, som representerer en utfordring for forståelse parasitten oppførsel under den innledende stadiet av infeksjon hos mennesker. Denne protozoan har en flagellar fase i både vektor- og pattedyr vertene, men det finnes ingen studier som beskriver sin motilitet i vivo. Målet med dette prosjektet var å etablere en live virveldyr sebrafisk modell for å evaluere T. cruzi motilitet i vaskulære systemet. Gjennomsiktig sebrafisk Larvene ble injisert med fluorescently merket trypomastigotes og observert med lys ark fluorescens mikroskopi (LSFM), en noninvasive metode for å visualisere levende organismer med høy optisk oppløsning. Parasitter kan bli visualisert over lengre tid på denne teknikken er relativt lav risiko for photodamage forhold til AC confocal eller epifluorescence mikroskopi. T. cruzi parasitter ble observert i sirkulasjonssystemet av live sebrafisk i ulike størrelser blodkar og eggeplomme. De kan også bli sett knyttet til eggeplomme sac veggen og til atrioventrikulær ventilen til tross for sterke krefter forbundet med hjertet sammentrekninger. LSFM av T. cruzi-inokulerte sebrafisk Larvene er en nyttig metode som kan brukes til å visualisere sirkulerende parasitter og vurdere deres tropism, migrasjon og motilitet i dynamisk miljø av det kardiovaskulære systemet av levende dyr.
Chagas sykdom er forårsaket av protozoan parasitten T. cruzi. Ca 6 til 7 millioner mennesker verden over er infisert med T. cruzi. Sykdommen blir overført i Latin-Amerika, men har blitt rapportert i USA, Canada, og mange European samt noen vestlige Stillehavet land, hovedsakelig på grunn av migrering av infiserte individer1. Chagas er hovedsakelig vektor-borne og overføres til mennesker ved kontakt med avføring av hematophagic og Triatominae, kjent som “kissing bugs”. Imidlertid kan T. cruzi også overføres via blodoverføringer, vertikal overføring fra mor til barn eller inntak av mat forurenset med parasitter2. Den akutte fasen infeksjonen er hovedsakelig asymptomatisk eller constitutively symptomatisk og varer fra 6 til 8 uker, etter som engasjement av immunsystemet styrer parasitten belastning, men fullstendig eliminere ikke smitte3. De fleste deretter inn en kronisk asymptomatisk fase; men utvikler nesten 30% av pasientene en symptomatisk kronisk fase, der cardiac systemet og sjeldnere i fordøyelseskanal og nervesystem er kompromittert4. Dette scenariet presenterer en utfordring for sykdommer behandling og kontroll siden det finnes ingen vaksiner, og det er bare to effektiv legemidler for Chagas: benznidazole og nifurtimox. Begge behandlingene krever lengre administrasjon og kan ha alvorlige bivirkninger2.
Økt forståelse av virkemåten til T. cruzi er oppførsel i vivo nøkkelen til å bestemme parasittiske migrasjon og mobilnettet vedlegg invasjonen i host; mangel på modeller i vivo begrenser utviklingen av romanen terapeutiske metoder. In vitro studier av T. cruzi har vist at motilitet på trypomastigotes er viktig for binding til verten cellemembraner og påfølgende mobilnettet invasjon5. Energi uttømming i trypomastigotes i co kultur med en utsatt cellen linje har vist seg å redusere mobilnettet invasjonen6. Interessant, i trypanosomatids, har flagellar bevegelse også blitt karakterisert som en evasion mekanisme mot parasitten-spesifikke antistoffer7.
Flagellar motilitet har vært grundig studert i vitro i Trypanosoma brucei, et nært beslektede parasitten som forårsaker Sovesyke8. In vitro studier av motilitet i disse trypanosomes viste at simulering av betingelsene for blod eller kroppsvæsker, inkludert viskositet og tilstedeværelsen av hindringer representant av blodceller, er viktig for parasitten fremover bevegelse9 . Idet av ennå er det ikke mulig å visualisere bevegelsen av parasitter i blodet i vivo.
Sebrafisk Larvene er en effektiv modell å studere vert-patogen interaksjoner i vivo. De er små, rimelige og relativt enkle å heve sammenlignet med andre etablerte virveldyr modeller for Chagas sykdom. Sebrafisk har medfødte og adaptive immunsystem ligner på mennesker, men deres adaptive immunsystemet begynner å utvikle på 4 dager innlegget befruktning (dpf) og er ikke moden for en annen flere uker10. Under tidlig utvikling, når bare makrofager er til stede, er det et stort vindu for å studere parasitten oppførsel uten umiddelbare immun forstyrrelser10. Den største fordelen av å utnytte sebrafisk larver som virveldyr modell for å studere patogen atferd ligger i deres optisk åpenhet, noe som gjør dem mottakelig for mikroskopiske screening og imaging11. I tillegg finnes det flere verktøy for å manipulere fisk genetikk. Casper belastningen er for eksempel en mutant linje av sebrafisk med ingen pigmentering, gjøre dyret helt gjennomsiktig og nyttig for visualisering av organer og sanntidssporing injisert celler12.
En nøkkel begrensning av langsgående observasjon av raskt bevegelige parasitter i live sebrafisk bruker AC confocal eller epifluorescence mikroskopi ligger i umuligheten i bildebehandling på høy oppkjøpet hastigheter og store gjennomtrenging dyp med god bildekvalitet og lav risiko for photodamage. Lys ark fluorescens micsroscopy (LSFM) er en ny bildeenhet teknikken som overvinner disse begrensningene for å tillate disse observasjonene. Med ett mål for å oppdage fluorescens og en andre ortogonale belysning målet som bare lyser opp fokalplanet for gjenkjenning målsettingen, er det mulig å få høy resolution optisk deler som AC confocal mikroskop, men med betydelig redusert photodamage, selv når det gjelder epifluorescence mikroskopi13. LSFM teknikken brukes her kalles enkelt flyet belysning mikroskopi (SPIM), som et tynt ark av lys lyser opp en eneste fly innen sebrafisk larvene.
Målet med denne metoden er å etablere larver sebrafisk som levedyktig ikke-infeksjon modell for å forstå T. cruzi motilitet og relaterte atferd i vivo. Dette vi injisert gjennomsiktig sebrafisk Larvene med fluorescently merket trypomastigotes, Mobiltlf skjemaet ansvarlig for smitte av mennesker, og identifisert bevegelsen av T. cruzi i hjerte sirkulasjon av sebrafisk bruker LSFM.
Denne studien fremhever fordelene ved sebrafisk som en dyr modell for å studere patogen atferd i vivo. Spesielt denne studien foreslår en metode for å visualisere patogen T. cruzi i sitt naturlige miljø: hematic sirkulasjon. Miljøet på den sirkulasjons microenvironment i fisk sammenlignes for pattedyr, og trypanosomatids har utviklet seg mekanismer for reise, gå utenom immunsystemet og feste til celler for infeksjon i det miljø25. Denne protokollen gir en beskrivelse av en optimal prosedyren kultur T. cruzi i human celle linje og påfølgende isolering av flagellar former for fluorescerende merking. Det viser deretter de aktuelle innstillingene for vellykket injeksjon av parasitter i gjennomsiktig sebrafisk for senere montering og visualisering ved hjelp LSFM. Til slutt gir denne protokollen forslag for effektive i vivo bildebehandling parasitten plassering og bevegelse i omløp bruker LSFM.
Flagell av trypanosomes framgår bakre regionen, strømmer fra celle og henger gratis på den fremre delen av organismen26. T. cruzi driver selv ved å vinke flagell foran kroppen, som betraktes parasittens hele kroppen. Flagellar bevegelse er ikke bare uunnværlig for parasitten motilitet, som i tilfelle av T. brucei27 (den utløsende agenten for Sovesyke), men det er også brukt for mobilnettet infeksjon, som har blitt vist i T. cruzi5 ,28. Selv om sebrafisk ikke naturlig vert for T. cruzi, kan det parasite motilitet studeres i et utviklingsland hjerte sirkulasjonssystem ved hjelp av protokoller som beskrevet her. I tillegg finnes det trypanosomes arter som infiserer Karpefisker, klasse sebrafisk, som T. carassii og T. borreli25. Disse parasitten artene kan brukes til å studere i sanntid bevegelser og vedlegg mekanismer for disse trypanosomatids; slike studier kan låne innsikt i pattedyr celle infeksjon prosessen.
I denne studien injisert motile T. cruzi parasitter ble observert reiser gjennom hjerte sirkulasjon av inokulerte fisk, flytte sammen med ugjennomsiktig erytrocytter og følge strukturer i kardiovaskulære systemet veggene. Vi brukte en hjemme-bygget LSFM med en 10 X akromatisk lenge arbeidsavstand luft målsetting (17,6 mm) for belysning arm med en numerisk blenderåpning på 0,25. En 40 X apochromatic vann nedsenking målet med en numerisk blenderåpning på 0.8 og en arbeidsavstand på 3,5 ble brukt for påvisning armen. Gjenkjenning målet var oppslukt i prøven kammeret, mens belysning målet var utenfor kammeret. En port i kammeret forseglet med en dekkglassvæske og optisk lim tillatt for belysning strålen inn i kammeret, som avbildet i Lorenzo et al. 18 for belysning, vi brukte en 50 mW DPSS laser på 488 nm hvis makt var modulert av et Acousto optisk Tunable Filter. Gjenkjenning banen brukes filtre kompatibel med grønn fluorescerende Protein (GFP) eller FITC. Lys ark mikroskop kapillær eksempel holderen (helst med automatisk rotasjon) og temperaturkontroll av prøve chamber bør være egnet for dette programmet. Mikroskopet skal være justert og kalibrert i henhold til produsentens instruksjoner eller brukerens laboratorium standardprotokoller før oppkjøpet, om nødvendig. I denne protokollen kontrollert vi mikroskopet bruker SPIM programvare19.
Det er viktig å merke seg at i sirkulasjon av sebrafisk, larvene parasittiske vedlegg er effektiv. I kardinal blodåre var parasitter knyttet til opptil flere minutter; i hjertet holdt de på ventiler og vegger, oscillerende med hjertet sammentrekninger. Videre studier fortsatt for å belyse om T. cruzi samhandler med de flytende erytrocyttene som Drive i retning av blodstrøm. Tidligere i vitro studier har vist at tilstedeværelsen av solid strukturer (dvs., blod celler) eller økt viskositet av væsken som etterligner blod i vitro, har en betydelig effekt på motilitet og hastighet av parasitten 9.
Det er mange spørsmål i løpet av infeksjon av T. cruzi hos mennesker etter amastigotes rømme phagocytic cellene: først infiserte cellen type29. For eksempel, hvordan de kommer til deres mål organer? Hva er mekanismene for tropism til foretrukket organer, som hjerte, fordøyelseskanal og sentralnervesystemet systemer? Interessant, i denne studien var parasitter opprinnelig avbildet i hjertet fordi det var den høyeste tettheten av parasitter. Men CFSE signalet senere akkumulert i utviklingsland tarmen av 7 dager innlegget injeksjon. Selv om anatomi av fisk og pattedyr er forskjellige, viser resultatene av denne studien en form for tropism, som det ble observert at parasitter utstilt tropism mot kjente foretrukne målet organer til tross organismebiologi forskjeller. En betydelig begrensning av denne studien gjelder temperaturen brukes i forsøkene. Sebrafisk Larvene bør holdes rundt 28 °C i løpet av hele fremgangsmåten. Selv om denne temperaturen kan være lik vektor verten (insekter og kan Triatominae), er det ganske forskjellig fra den hjertelig-blod pattedyr som utgjør de endelige vertene (rundt 37 ° C). T. cruzi er kjent for å ha flagellar levende skjemaer i begge verter; Det er imidlertid viktig å huske at denne faktoren kan ha en effekt i atferden til dyr i vivo.
Selv om fish´s adaptive immunsystemet ikke er moden til 4 uker post befruktning, er det medfødte immunsystemet tidlig i utviklingen10. Så tidlig som 48 eller 96 hpf, ble phagocytic celler observert å ha omsluttet merket trypanosomes (data ikke vist). Dette begrenser vinduet tid for visualisering av parasitten. Men hvis en studie var å fokusere på å vurdere fish´s immunforsvaret, kan injeksjon på senere stadier bli anbefalt. Også kan injeksjon av parasitter i transgene fisk linjer med merket makrofager eller andre celler i immunsystemet være nyttig i å studere parasitten vedlegg og mulig endocytose mekanismer. Det er viktig å merke seg at hvis parasitter er merket med CFSE, transgene celle etiketter skal ikke GFP, og en markør i den gule / røde enden av spekteret er nødvendig.
For å vurdere detaljert bevegelsesretning parasitt, kan det være nyttig å følge deres bane i 3 dimensjoner (3D). For 3D-visualisering og gjenoppbygging av prosessen er Høyhastighetssystem nødvendig. Med utstyr som brukes i denne protokollen, er det bare mulig å visualisere parasitter på ett plan. I dette tilfellet prioritert vi opprettholde fokalplanet stabilitet i parasitten bevegelse og spille inn sin bane på ett plan.
Metodene som er foreslått her baner vei å undersøke nærmere parasitten atferd i hjerte sirkulasjon. I sammendraget er viktige trinnene i imaging live fluorescerende parasitter i sebrafisk Larvene:(i) bruk av tidlig skravert embryo (24-48 hpf) eller larver eller dyr mellom 72-96 hpf med ingen pigmentering slik at de er gjennomsiktig og lett å injisere; (ii) bilde Larvene så snart som mulig etter injeksjon å unngå parasitten godkjennes av phagocytic celler. (iii) fokusere LSFM på stedet av interesse (f.eks, perikard regionen) og holde fokus. Denne romanen prosedyren kan visualisering av trypomastigotes i et miljø sammenlignes med sin infeksjon naturlig nisje, gir for første gang muligheten til å studere T. cruzi i en levende organisme.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Convocatoria Interfacultades fra Vicerrectoría de Investigaciones de la Universidad de los Andes, og USAID forskning og innovasjon kameratskap programmet. Vi takker Juan Rafael Buitrago og Yeferzon Ardila for fisk vedlikehold og assistanse.
0.5-10 μL Micropipette | Fisherbrand | 21-377-815 | |
Agarose RA | Amresco | N605 | Regular |
Agarose SFR | Amresco | J234 | Low Melting point |
Aquarium salt | Instant ocean | SS15-10 | |
Cell Count chamber | Boeco | Neubauer | |
Cell culture flasks | Corning | 430639 | |
Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
CFSE | ThermoFisher | C34554 | |
Detection objective | Nikon 40x 0.8NA | 40x CFI APO NIR | |
DMEM medium | Sigma-Aldrich | D5648 | |
Dumont #5 fine forceps | World precision Instruments | ||
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
Fetal calf serum (FCS) | Eurobio | CVFSVF00-01 | |
Filter | Chroma | ET-525/50M | |
Glass capillaries for embryo mounting | Vitrez Medical | 160215 | |
Glass capillaries for pulling needles | World precision instruments | TW100-4 | |
Glucose | Gibco | A2494001 | |
HEPES | Gibco | 156300-80 | |
Incubator | Thermo Corporation | Revco | |
Larval microinjection mold | Adaptive Science Tools | I-34 | |
Laser | Crystalaser | DL488-050 | |
L-glutamine | Gibco | 250300-81 | |
Methylene blue | Albor Químicos | 12223 | |
Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
Micromanipulator system | Sutter Instrument | MP-200 | For LSFM |
Micropipette puller device | Narishige | PC-10 | |
Microscope | Olympus | CX31 | |
Microscope (inverted) | Olympus | CKX41 | |
Multipurpose microscope | Nikon | AZ100M | |
Neubauer counting chamber | Boeco Germany | ||
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-163 | |
Petri dish 94×16 | Greiner bio-one | 633181 | |
Plastic pasteur pipette | Fisherbrand | 11577722 | |
Rotation stage | Newport | CONEX-PR50CC | |
RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R4130 | |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
Stereoscope | Nikon | C-LEDS | |
Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | |
TRIS | Amresco | M151 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | R-001-100 | |
Tubes 15 ml | Corning | 05-527-90 |