Summary
Burada, hücre göç TIP60 tükenmiş MCF10A meme epitel hücreleri kullanarak bir yara iyileşmesi tahlil gerçek zamanlı izleme mevcut. Canlı hücre görüntüleme teknikleri bizim protokolündeki uygulanması bize analiz ve tek hücreli hareket içinde gerçek zaman ve zaman içinde görmenize olanak sağlar.
Abstract
Yara iyileşmesi tahlil etkilidir ve bir hücre göç içinde vitroçalışma için en ekonomik yolu. Geleneksel, görüntüleri başlangıç ve faz kontrast mikroskop kullanarak bir deney sonunda alınır ve hücreleri geçiş yeteneklerini yaraların kapatılması tarafından değerlendirilir. Ancak, hücre hareketi dinamik bir olgudur ve geleneksel bir yöntem tek hücreli hareketi izlemek için izin vermez. Geçerli yara iyileşmesi deneyleri artırmak için biz canlı hücre görüntüleme teknikleri hücre göç gerçek zamanlı olarak izlemek için kullanın. Bu yöntem takip sistemi bir hücreyi temel alarak hücre geçiş hızını belirlemek için bize izin verir ve hücre göç ve Hücre proliferasyonu arasında net bir ayrım sağlar. Burada, yara iyileşmesi deneyleri meme epitel hücreleri TIP60 varlığı ile etkiledi farklı geçiş yeteneklerini çalışmaya görüntülemede canlı hücre kullanımını göstermektedir. Hücre hareketliliği son derece dinamik olduğu için bizim yöntem yara yara kapatma yara iyileşmesi deneyleri için kullanılan geleneksel görüntüleme teknikleri ile çekilen fotoğrafını daha iyileşme süreçleri daha fazla ilgili bilgiler sağlar.
Introduction
Histon ve sigara Histon proteinleri1,2acetylate bir lisin asetiltransferaz HIV Tat etkileşimli protein 60 kDa (TIP60) olduğunu. Fonksiyonları transkripsiyon, DNA-hasar onarım ve Apoptozis1,3,4,5,6, de dahil olmak üzere birden çok sinyal yollar, uygulamaları bulunmaktadır bulundu 7 , 8. Ayrıca, TIP60 kez downregulated kanserleri ve onun downregülasyon kanser metastaz ile ilişkilidir ve zavallı hayatta kalma oranları9,10,11,12, 13,14. Tümör metastazı kanserle ilgili ölüm başlıca nedenidir. Çok adımlı bir işlemdir ve geçiş ve tümör hücreleri işgali bitişik dokularda15,16içine metastaz ilk adım içerir. Bunu yapmak için tümör hücreleri ilk birincil tümör kitle, ya topluca işgal bir hücre levha şeklinde gelen ayırmanız gerekir veya müstakil olarak tek hücreleri17. Bu işlem sırasında tümör hücreleri kez Mezenkimal geçiş (EMT), morfoloji ve hücre yapışma yeteneği17,18değişimler sonuçta epitel tabi.
Birkaç teknik geçiş eğitim için geliştirilmiştir ve vitroişgali yetenek tümör hücreleri. Bunlar arasında en verimli ve ekonomik19yara iyileşmesi tahlil olduğunu. İlk olarak, bu yöntem Konfluent monolayer hücre, böylece hücrelerin göç ve boşluğu kapatmak izin üzerinde yapay bir boşluğu oluşturulmasını içerir. İkinci olarak, görüntüleri eksikliklerin başlangıç ve deneme sonunda yakalanabilir. Son olarak, bir karşılaştırma boşluğu kapatma hücre geçiş hızını belirlemek için kullanılır. Faz kontrast mikroskop genellikle geleneksel yara iyileşmesi deneyleri için görüntüleri yakalamak için kullanılır. Başka bir yara iyileşmesi tahlil vivo içinde tümör hücre göç kısmen benzer avantajdır. Benzer şekilde vivo içinde tümör metastazı için yara iyileşmesi deneyleri hücre göç epitel sayfaları toplu göç ve müstakil tek hücre geçiş gösterir.
Ancak, hücre göç dinamik olarak bilinir ve hücre gerçek zamanlı olarak hareket belgelemek için bir ihtiyaç vardır. Örneğin, geleneksel bir yara iyileşmesi tahlil tek hücreli hareket analiz etmek bir araştırmacı izin vermez. Öte yandan, yara iyileşmesi deneyleri için kültürlü hücreleri çoğu kez hücre çoğalması etkisizleştirmek için serum aç. Bu boşluğu kapatma nedeniyle hücre çoğalması olasılığını ekarte için yapılır. Yine de, hala olacak bazı yayılması ve hücre ölümü ve faz kontrast görüntüler önce ve deneme sonra ikisi arasında ayrım yapamaz.
Canlı hücre görüntüleme tekniği konvansiyonel yara iyileşmesi deneyleri bu sınırlama giderir. Canlı görüntüleme mikroskop kullanarak bir CO2 kuluçka ve uygun sıcaklık kontrolü ile birlikte, araştırmacılar boşluk boyutu ölçebilirsiniz ve aktif olarak göç hareketi izleme hücreleri iken zamanla kapatılması hızını kendi bulunan uçları invaziv açık. Bu nedenle, canlı hücre hücre geçiş izlemek için Imaging uygulanması yalnızca hücre göç daha iyi görselleştirme vermez ama aynı zamanda hücre göç ve Hücre proliferasyonu, böylece bir daha sağlayan ayırt imkanı sağlayacak hücre göç güvenilir analizi.
Bu çalışmada, MCF10A meme epitel hücreleri yara iyileşmesi tahlil ve canlı hücre hücre göç TIP60 rolü eğitim için Imaging göstermek için kullanılmıştır. MCF10A hücreleri artan göç yeteneklerine TIP60 tükenmesi sonuçlanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hazırlık
- MCF10A kültür ortamı hazırlamak: Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) / F12 (1:1) % 5 ile ATI serum, 20 ng/mL epitelyal büyüme faktörü, 0,5 mg/mL hidrokortizon, 100 ng/mL kolera toksin ve 10 µg/mL insülin.
- Serum-Alerjik orta hazırlamak: 20 ng/mL epitelyal büyüme faktörü, 0,5 mg/mL hidrokortizon, 100 ng/mL kolera toksin ve 10 µg/mL insülin ile DMEM/F12 (1:1).
- Aşağıdaki siRNA sırasını kullanın:
siControl:
İleri: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3'
Ters: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3'
siTIP60:
İleri: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3'
Ters: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3' - 10 cm hücre kültür yemekleri ve 24-şey tabak kullanın.
2. geçici TIP60 kullanarak siRNA tükenmesi
- Gün 1, aliquot 15 µL transfection reaktif (Örneğin, Lipofectamine RNAiMAX) ve 2 mL serum orta (Örneğin, Opti-MEM) azaltılmış ve bunları sırasıyla her siRNA (10 µM hisse senedi) 10 µL ile karıştırın.
- Karışımı, oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.
- 1 x 106 MCF10A hücreleri ile birlikte kültür orta 10 cm tabak içinde 3 mL tohum. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
- SiRNA karışımı damla damla 10 cm yemek için ekleyin.
- 37 ° C kuluçka makinesi koymadan önce hücreleri eşit dağıtılır sağlamak için çanak sallamak.
- Kuluçka 6 h sonra siRNA içeren Orta 8 mL taze kültür orta ile değiştirin.
- 2 günü siRNA karışımları yönteminin hazırlamak ve onları, oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.
- 8 mL 1 gün eklendi kültür ortamının dışarı Aspire edin ve eski yerine koymak o ile 3 mL taze kültür orta.
- SiRNA karışımı ikinci parti yemekleri damla damla ekleyin. Bulaşıkları reaktifleri tam da kuluçka koymadan önce karıştırılır emin olmak için salla.
- 6 h sonra siRNA içeren Orta 8 mL taze kültür orta ile değiştirin.
3. tohum hücreler yara iyileşmesi tahlil için
- Günde 3, orta atın ve 2 mL serum fizyolojik (PBS) arabelleği fosfat tamponlu bir kez hücrelerle yıkayın. PBS arabellek atmak.
- SiControl ve siTIP60 tedavi hücreleri plaka 1 mL 1 x tripsin-EDTA arabelleği ekleyerek trypsinize. Kuluçka makinesi 20 dk için geri koydum.
- 4 mL tam kültür ortamının her plakasına eklemek, hücreleri pipetting tarafından resuspend ve onları bir 15 mL tüp aktarın.
- 5 min için 200 gr, santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
- 5 mL serum-Alerjik orta de içeren hücreleri yeniden askıya alma ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
- Bir hücre süspansiyon olarak 6 x 105 hücre/mL siControl ve siTIP60 için hazırlamak; hücreleri iyi karışık olduğundan emin olun. Hücre süspansiyon 500 µL % 100 confluency emin olmak için bir 24-şey plaka bir şey için ekleyin. 5-6 kuyu her siControl ve siTIP60 için tohum.
- Yavaşça ileri geri plaka ve sonra için bile dağıtım sağlamak için yan sarstı. Dairesel hareketlerle kaçının. Plaka 24 h için kuluçka bırakın.
- TIP60 devirme verimliliğini kontrol etmek için kalan hücreleri hasat. Bunu yapmak için kalan hücre süspansiyon 5 min için 200 gr, santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
- Ticari bir reaktif kullanarak RNA üreticinin protokolüne yalıtmak ve devirme etkinliğini değerlendirmek için gerçek zamanlı kantitatif PCR için devam edin.
4. yara oluşturma
- Faz kontrast mikroskop altında hücreleri tamamen bağlı emin olmak için denetleyin. Hücreleri mikroskop altında gözlemlemek (4 X, 10 X ve 20 X büyütme) hücreleri tamamen hücrelerinin Konfluent monolayer oluşturmuştur bağlı olduğu sağlamak.
Not: siControl hücreleri genellikle daha iyi siTIP60 hücreleri ekleyin. TIP60 tükenmesi hücreleri daha fazla gibi Mezenkimal20yapar çünkü bu bekleniyor. Burada, normal benchtop beyaz ışık faz kontrast mikroskop kullanılır. - Yara oluşturmak için hafifçe merkezi 200 µL pipet ucu ile iyi arasında düz bir çizgi sıfırdan; oluşturulan yara kuyu çapı aynı uzunluğudur. Tüm kalan kuyular için bu adımı yineleyin. Yeni bir pipet ucu her şey için kullanın.
- Yavaşça kullanarak her de 5 kez serum içermeyen yıkama müstakil hücre kaldırma için orta.
- Her şey için 1 mL serum-Alerjik orta ekleyin ve canlı hücre görüntüleme için devam edin.
5. Kurulum Canlı hücre görüntüleme
- Mikroskobunun açmak ve sıcaklık kontrol en az 1 h canlı oda sıcaklığında 37 ° c ulaştığından emin olmak için görüntüleme hücreli ayarlamadan önce
- Canlı hücre görüntüleme başlamadan önce karbondioksit (CO2) gaz arzı açın. CO2 konsantrasyonu %5 için ayarlayın.
- 24-şey plaka mikroskop sahnesinde yerini ve görüntüleme için 10 X büyütme ile objektif lens seçin. Kamera yerine göz mercekleri verilmiş ışığına doğrudan ve yara ve çevresindeki hücreleri bulmak için odağı ayarlayın.
Not: Bu durum, faz kontrast ile beyaz ışık kullanıldı. - Her şey yarada konumunu işaretlemek için bir canlı hücre gözlemci sistemi kullanın.
Not: Otomatik sahne canlı hücre görüntüleme sisteminin birden çok pozisyonlarda resim alma sağlar. Görüntüleri bir kez her ara her işaretli konumuna alınır. - Kadar zaman koşul ayarla: 1s aralığına ve 72 h süresi; Bu ayar göre sistem resimler işaretli her konumda her saat 72 h. herhangi bir istenen zaman aralığını ayarlamak için ve izleme dönemi olacak.
Not: Bu hücreler 72 h sonra serum serbest ortamda ölmeye başlayacak çünkü burada, bir süre 72 h en iyisi.
6. tek hücreli hareketleri izleme
- 72 h. hem JPEG formatında görüntülerin ve AVI formatında videolar olarak verdikten sonra verileri veri verin.
Not: ImageJ yazılım sadece AVI formatında videolar tanıyabilir çünkü bu önemlidir. SiTIP60 ve siControl hücreler arasında farklı hücre geçiş hızları videoda açıkça görülebilmektedir. - AVI video ImageJ yazılımında açın.
- MTrackJ eklentisi (eklenti-gerekir indirilen ve ayrı ayrı yüklü) açın: Eklentiler > MtrackJ.
- Videodan MtrackJ araç çubuğunda "Ekle" sekmesini tıklatarak seçilen tek hücreler için bir parça ekleyin. İnvaziv ön ucunda bir hücre ve kendi kendine geçirebilirsiniz bir hücreyi seçin (tek hücreli geçiş). Seçilen hücreleri hareketini videoda izleyin ve onları iz MtrackJ kullanarak.
- Araç çubuğundaki "ölçü" sekmesine tıklayarak hareketinin uzaklığı ölçmek.
Not: Burada, tek hücreleri, birçok siTIP60 hücreleri tek hücre olarak taşındı, ancak zor tek hücreli hareketi, ölçümü yapma siControl neredeyse hiçbir hücrelerde alındı. Ancak, invaziv cephede yer alan hücreleri hareket hala takip ve siControl ve siTIP60 hücreleri hesaplanan. - AVI formatında parçaları ile video kaydetmek.
7. cep geçiş yeteneği miktar
- Miktar için 0 h, görüntüler ve görüntüleri, "n" h, ya siTIP60 ya da siControl hücreler yara tamamen kapattığından ne zaman nerede "n" için timepoint anlamına gelir seçin.
Not: siTIP60 hücreleri yaralarda neredeyse tamamen kapalı olarak burada, 48 h, seçildi. - Aşağıdaki formülü kullanarak ImageJ kullanarak yüzde geçişi ölçmek: (0 h - alan "n" h, yara yara alan) / alanına yara 0 h x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Canlı hücre hücre görüntüleme tabanlı geçiş testin genel şeması
Şekil 1A bu protokol bir şemadır. MCF10A hücreler tipik epitel Morfoloji gösterdi siControl ile transfected. TIP60 tükenmesi sonra MCF10A hücreleri kontrol hücreleri (şekil 1B) kıyasla daha Mezenkimal.
TIP60 devirme verimliliği incelenmesi
Şekil 2 TIP60 devirme verimliliği gösterir. TIP60 ifade düzey siTIP60 tedaviden sonra önemli ölçüde azalmıştır. TIP60 ek olarak, ifade geçirmeyle ilgili birkaç hücre proteinlerin de muayene20edildi. Örneğin, epitel bir işaretleyicidir, epitel adezyon molekülü (EpCAM), ifade, oysa azalma ifadeler fibronektin (FN1) ve SNAIL2 (SNAI2), her iki EMT sürücü olan artış üzerine TIP60 tükenmesi. Bu verileri canlı hücre görüntüleme için kullanılan MCF10A hücre TIP60 seviyelerinde yeterince azaltıldı göstermektedir.
Dinamik hücre göç TIP60 tükenmesi değiştirir
Şekil 3 videoları için siControl ve siTIP60 hücreleri alınan gösterir. Videolar için siControl göre siTIP60 daha hızlı bir hücre göç açıkça gösteriyor. Bunun dışında hücre göç siControl ve siTIP60 hücreler arasında dinamik bir fark da (daha fazla tek hücreli hareketi siTIP60 hücrelerde gözlendi, ancak bir levha taşındıYani, siControl hücreleri) gözlenmiştir.
Hücre Migration TIP60 devirme sonra artış
Şekil 4 siControl ve siTIP60 hücrelerin hücre göçü miktar gösterir. Geçirilen hücrelerin yüzdesi TIP60 tükenmesi sonra önemli ölçüde arttı.
TIP60 Tükenmesi hücre göç desenini değiştirir.
Şekil 5 videoları izleme tek hücreli hareketi gösterir. En siTIP60 hücreleri tek hücre geçiş gösterdi, ancak siControl hücrelerin çoğu hücre çarşaf ve gösterdi sadece iki hücreleri tek hücre göç, parçası olarak topluca göç. Hücre geçiş desen değişimler tükenmiş TIP60 hücrelerle daha Mezenkimal fenotip gösteriyor.
Şekil 1: deneysel genel bakış ve temsilcisi görüntüler. Protokolü'nün(a)şema. (B) temsilcisi görüntüleri MCF10A hücre siControl veya siTIP60 ile transfected. MCF10A hücreleri daha Mezenkimal Morfoloji TIP60 tükenmesi sonra gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: TIP60 verimli bir şekilde siTIP60 transfection sonra tükenmiş. Gerçek zamanlı kantitatif PCR TIP60, EpCAM, FN1ve SNAI2ifade düzeyini kontrol etmek için kullanıldı. Toplam RNA üretimi'nın protokol sonrası Trizol reaktif kullanarak izole edildi. her örneğinin toplam RNA'ın 2 µg cDNA yapmak için kullanıldı. Sonuçları kat-değişiklik olarak temsil edilir. Aktin bir iç denetimi olarak kullanıldı. Hata çubuğu en az 3 bağımsız deneyler standart sapma gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: siControl ve siTIP60 hücrelerinin canlı hücre görüntüleme klipleri göstermek farklı desenler hücre hareketinin. Zaman aralığı için 1 h kuruldu ve süresi 72 h için yapıldı. Video Zeiss canlı hücre gözlemci kullanarak çekildi. Bu video indirmek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: miktar hücre geçiş yüzdesi. (A)temsilcisi görüntüleri canlı hücre görüntüleme videolardan elde. 0 h ve 48 h çekilmiş olan fotoğraflar kullanıldı. (B) miktar 48 saat içinde hücre geçiş yüzdesi yapıldı aşağıdaki formülü kullanarak ImageJ yazılımı kullanarak: (0 h - alan "n" h, yara yara alan) / alanına yara 0 h x 100. Hata çubuğu en az üç bağımsız deneyler standart sapma gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Live-hücre görüntüleme klipleri göstermek tek hücreli hareket takibi. Renkli çizgiler her izole tek hücrenin göçmen izini göster. Bu video indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu hücre geçiş sürecinde, her iki hareket yapisan yaprak şeklinde hücreler olabilir bilinmektedir; gevşek kümeleri; ya da tek, izole hücreler. Modu ve hücre işgalinin dinamik bir şartla diğerine değişebilir ve fenotip saat içinde değiştirebilirsiniz. Geleneksel yara iyileşmesi tahlil anlık görüntü resimleri 12 veya 24 s gibi bir uzun zaman aralığı mikroskopla alınan temel alır. Bu yara kapatma dinamik ve hücre hareketlerin desen yakalamak zorlaştırır.
Öte yandan, live-hücre görüntüleme sistemleri hücre geçiş çok daha kısa bir aralığı (30 dakika veya 1 h) ve el ile çekilen görüntülerde mümkün değil tam olarak aynı konumda izlemek. Sistem otomatik ve araştırmacılar deneyleri sonundaki verilerini vermek yeterlidir. Bu hücre hareket paterni ve gerçek zamanlı olarak yara kapatma sürecini izlemek sağlar. Bu çalışmada, dinamik hücre hareket yakalama, aynı zamanda denetim veya TIP60 tükenmiş hücreler yara kapatma işleminin birleşme deneyleri yara iyileşmesi bir nicel canlı hücre görüntüleme sistemi sağlar. TIP60 tükenmiş hücreleri izole tek hücreler olarak (şekil 3 ve şekil 5) taşındı, ancak canlı hücre görüntüleme sistemi kullanılarak yapılan videodan siControl hücrelerin çoğu yapisan bir levha taşındı.
Hücre çoğalması ve hücre ölümü bir yara iyileşmesi tahlil hücre göç çalışmanın karmaşık. Bu nedenle, yara iyileşmesi tahlil aracı olarak serum serbest hücre çoğalması etkisini en aza indirmek için gerçekleştirilir. Ayrıca, TIP60 nakavt hücre yaşam üzerindeki etkilerini azaltmak için optimize edildi. Ancak, hücre çoğalması ve hücre ölümü yara iyileşmesi deneyleri içinde etkileri ortadan kaldırmak mümkün değildir. Anlık görüntüleri tek yakalama yara kapatma yara kapatma hücre geçiş veya hücre çoğalması nedeniyle olup ayırt etmek imkansız hale belirli bir noktada zaman, olabilir. Canlı hücre görüntüleme hücre göç dinamikleri izler ve tek hücre hareket, araştırmacılar hücre göç hücre çoğalması ve hücre ölümü ayırt etmek için sağlayarak parça. SiControl hücreleri çoğunlukla yaprak şeklinde taşındı iken bu çalışmada, tek hücreli izleme geçiş yolu izole tek hücre siTIP60 durumda ortaya koydu. Canlı hücre görüntüleme sistemi aynı zamanda toplu hücre göç (hücreleri uyumlu bir grup geçirilenYani ) bir artış siControl hücrelere kıyasla siTIP60 hücrelerdeki ele geçirdi. Videolardan MCF10A siTIP60 daha fazla tek hücreli hareketleri ve epitel hücre yaprak siControl (şekil 5) kıyasla daha hızlı geçiş gösterdi.
Bu protokol için kullanılan çeşitli parametreler deneysel hatalarını önlemek için optimize edilmiş olması gerekir. İlk olarak, geçici transfection sonra hücre ölüm sayısı az hücre geçiş üzerindeki etkisini en aza indirmek için % 10 olmalıdır. Bu durumda, TIP60 tükenmesi hücre survival azaltabilir; Bu nedenle, hücre geçiş karmaşık gibi araştırmacılar bu potansiyel fenotip bilmeniz gerekir. Bu sorunu önlemek için araştırmacılar cep telefonu numarasını ve onların hedef gen tüketmek için kullanılan siRNA miktarı optimize etmek. MCF10A için 1 x 106 hücre 20 nM siTIP60 ile yapıldı Bu çalışmada en iyi duruma getirilmiş durumda. İkinci olarak, MCF10A hücreleri kümelenmiş ve saymak zor çoğu kez. Hücre sayımları hataları ilk hücre sayıları önemli bir fark arasında farklı koşulları neden olabilir ve bu yara iyileşmesi deneyleri karıştırıcı bir değişken olabilir. Bu sorunu önlemek için MCF10A hücreler için en az 20 dk. trypsinization durdurmak ve 20 kere kümeleri dağıtmak için ve saymak kolay hale getirmek için yukarı ve aşağı pipetting tarafından mix Ekle tam büyüme orta trypsinize. Üçüncü olarak, genellikle iyi merkezinde 24-şey plaka numaralı seribaşı sonra hücrelerdir. Hücreleri bile bir dağıtım sağlamak için tohum sonra yeniden askıya alma. Plaka da kuluçka koymadan önce ileri geri ve yan yana sallayın. Dördüncü olarak, TIP60 tükenmesi daha Mezenkimal ve böylece zor eklemek için hücreyi yapar. Bu durumda, plaka da kuluçka makinesine daha uzun bir süre için bırakın. 24 saat sonra hücreleri genellikle eklenir. Hücreleri hala düzgün iliştirilmişse, araştırmacılar hücre tohum için tam büyüme ortamı kullanımı olabilir ve eski yerine koymak o ile orta serum içermeyen hücreleri tamamen eklendiğinde. Bu hücreler genellikle tam orta 12 h sonra eklenir. Beşinci olarak, yara kenarına düzgün olmayabilir. Pürüzsüz kenarlar oluşturmak için tırmalamak hızını artırmak. Altıncı, yara mikroskop kameradan görselleştirmek için çok büyük olabilir. Yara oluşturmak için daha az güç ile 200 µL pipet ipuçlarını kullanın. Alternatif olarak, bir iğne daha küçük bir boşluk oluşturmak için kullanılabilir. Yedinci, tırmalamak sırasında ayrılır bazı hücreler yara nedeniyle yetersiz yıkama için yeniden ekleyebilirsiniz. Wells serum-Alerjik orta yerine PBS ile en az 5 kez yıkayın. Sekizinci, hücreleri birkaç yıkar sonra plaka ayırmak başlayabilir. Ancak, yıkar sayısı müstakil hücreler yara için yeniden atamanız değil da sağlamak için tehlikeye olamaz. Bu durumda, araştırmacılar hücreleri nazikçe 3 kez yıkama ve kuluçka makinesi içinde plaka yıkar geri kalanı için devam etmeden önce sakin hücreleri bildirmek için 1 h en fazla bir süre için bırakın. Dokuzuncu, mikroskop-ebilmek kaybetmek odak ve görüntüleri yarısını deneme bulanık hale gelebilir. Sıcaklık ayarlanan sahne mesafe üzerinde küçük bir etkisi olarak sıcaklık mikroskop çevresinde bir değişiklik neden olabilir. Araştırmacılar mikroskobunun teslim olması gerektiğini ve sıcaklık kontrol en az 1 h kuluçka makinesi hücreleri odaklanmak ayarlamadan önce warmed olduğunu emin olmak için deney başlamadan önce.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Jha laboratuvar onların yararlı tartışma ve Yorumlar için üyeleri teşekkür ediyoruz. S.J. kanser Bilim Enstitüsü of Singapore (R-713-006-014-271), Ulusal Sağlık Ulusal Araştırma Vakfı Singapur ve Singapur Milli Eğitim Bakanlığı, araştırma merkezleri mükemmellik girişimi'nin altında hibe tarafından desteklenmiştir Araştırma Konseyi (CBRG-Zen; BNIG11nov001 ve CS-IRG; R-713-000-162-511), Milli Eğitim Bakanlığı akademik Araştırma Fonu (MOE AcRF Tier 1 T1-2012 Ekim -04). Y.Z., G.S.C. ve C.Y.T. kanser Bilim Enstitüsü Singapur tarafından Singapur Ulusal Üniversitesi layık bir yüksek lisans bursu tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF10A cell | ATCC | CRL-10317TM | Breast epithelial cell |
| DMEM/F12 media (1:1) | Gibco | 11330-032 | MCF10A culture media |
| Epithelial growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Supplements for MCF10A culture media |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C-8052 | Supplements for MCF10A culture media |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | Supplements for MCF10A culture media |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | Supplements for MCF10A culture media |
| House serum | Gibco | 16050-122 | Supplements for MCF10A culture media |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | For MCF10A detach from plate |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | For counting cell |
| Opti-MEM reduced serum media | Gibco | 31985-070 | For siRNA mixture |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies | 56532 | Transfect reagent |
| Trizol reagent | Invitrogen/Life Technologies | 15596-026 | For mRNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | For cDNA generation |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5125 | For real time qPCR |
| 7500 Fast Real Time PCR system | Biosystems | Real time qPCR mechine | |
| 10-cm dish | Greiner bio-one | 664160 | For Knockdown experiment |
| 24-well plate | Cellstar | 662160 | For wound healing assay |
| siControl siRNA | Self designed | Self designed | CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT |
| siTIP60 siRNA | Self designed | Self designed | UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT |
| Live cell observer | Zeiss | Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments |
References
- Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).
- Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53. J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).
- Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage. Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).
- Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N.
- Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT. Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).
- Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity. Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).
- Sykes, S. M., et al. Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction. Mol Cell. 24 (6), 841-851 (2006).
- Tang, Y., Luo, J., Zhang, W., Gu, W. Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis. Mol Cell. 24 (6), 827-839 (2006).
- Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival. J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).
- Gorrini, C., et al. Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response. Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).
- Jha, S., et al. Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway. Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).
- Kim, J. H., et al. Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes. Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).
- Sakuraba, K., et al. Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer. Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).
- Subbaiah, V. K., et al. E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60. Oncogene. , (2015).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration. Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R.
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Zhang, Y., et al. TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program. J Mol Cell Biol. , (2016).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).
