Summary
Aqui nós descrevemos uma preparação superficial de hidrogel injetável à base de quitosana usando química imina dinâmico. São apresentados métodos para ajustar a força mecânica do hidrogel e sua aplicação em cultura de células 3D.
Abstract
O protocolo apresenta um método fácil, eficiente e versátil para preparar hidrogel baseado em quitosana usando química imina dinâmico. O hidrogel é preparado misturando-se soluções de glicol quitosana com um gelator de polímero sintetizado benzaldeído finalizado e hidrogel com eficiência é obtidos em vários minutos à temperatura ambiente. Por razões diferentes entre quitosana glicol, gelator de polímero e conteúdo de água, obtêm-se versátil hidrogel com tempos diferentes de gelificação e rigidez. Quando danificadas, o hidrogel pode recuperar suas aparições e módulo de elasticidade, devido a reversibilidade das obrigações imina dinâmico como crosslinkages. Esta auto reparáveis propriedade permite que o hidrogel ser injetável, uma vez que pode ser auto curado de peças espremidas de um hidrogel em massa integral após o processo de injeção. O hidrogel é também multi sensível a muitos estímulos bio-ativos devido ao status de equilibração diferente das obrigações imina dinâmico. Este hidrogel foi confirmado como bio-compatível e células de fibroblasto de rato L929 foram incorporados procedimentos padrão e a proliferação das células foi facilmente avaliada por um processo de cultivo de células 3D. O hidrogel pode oferecer uma plataforma ajustável para diferentes pesquisas onde um mímico fisiológico de um ambiente 3D para as células é lucrou. Juntamente com suas propriedades multi responsivos, auto reparáveis e injetáveis, o hidrogel potencialmente pode ser aplicados como várias transportadoras para drogas e células em futuras aplicações biomédicas.
Introduction
Hidrogel é materiais de polímero reticulado com grandes quantidades de água e propriedades mecânicas macias, e eles têm sido usados em muitas aplicações bio-medical1,2. Hidrogel pode oferecer um ambiente suave e molhado, que é muito semelhante ao ambiente fisiológico para células em vivo. Portanto, hidrogel tornaram-se uma das plataformas mais populares para cultura de células 3D3,4. Em relação à cultura de pilha do prato de Petri 2D, cultura de células 3D avançou rapidamente para oferecer que uma matriz extracelular (ECM) imitou o microambiente para células de contato e montar para fins de proliferação e diferenciação5. Além disso, o hidrogel contendo polímeros naturais poderia oferecer biocompatível e promovendo ambientes para as células a proliferar e diferenciar3. Hidrogel derivado de polímeros sintéticos é preferidos para seus componentes simples e claras, que excluem influências complexas como as proteínas de origem animal ou vírus. Entre todos os candidatos de hidrogel para cultura de células 3D, hidrogel que facilmente é preparados e têm uma propriedade consistente é sempre preferidos. A facilidade para ajustar propriedades do hidrogel para atender necessidades diferentes pesquisas é importante como bem6.
Aqui apresentamos uma preparação superficial de um hidrogel de glicol baseado em quitosana usando química imina dinâmico, que se torna uma plataforma versátil de hidrogel para cultura de células 3D7. Neste método, conhecido biocompatível glicol quitosana são usados para estabelecer quadros de redes do hidrogel. Seus grupos aminoácidos são reagiu com um glicol de polietileno benzaldeído encerrado como o gelator de polímeros que formam ligações de imina dinâmico como crosslinkages de hidrogel8. Obrigações de imina dinâmico podem formar e decompor reversível e responsiva ao redor, dotando o hidrogel com quitosana mecanicamente ajustável redes9,10,11. Devido ao seu conteúdo de água de alto, materiais biocompatíveis e forças mecânicas ajustáveis, o hidrogel é aplicado com sucesso como um andaime para células L929 em cultura de células 3D12,13. O protocolo aqui detalha os procedimentos, incluindo a síntese de polímeros gelator, preparação de hidrogel, incorporação de célula e cultivo celular 3D.
O hidrogel também mostra várias outras características devido a sua crosslinkages de imina dinâmico, incluindo sua multi responsivo aos vários estímulos bio-(ácido e pH, piridoxal derivados de vitamina B6, papaína de proteína, etc), indicando que o hidrogel pode ser induzido a decompor-se sob condições fisiológicas8. O hidrogel é também auto reparáveis e injetável, o que significa que o hidrogel pode ser administrado através de um método de injeção invasiva mínima e ganhar uma vantagem em droga e célula entregas14,15. Pela adição de aditivos funcionais ou gelators de polímero preconcebidos específico, o hidrogel é compatível para obter propriedades específicas como magnética, temperatura, pH-responsivo, etc.16,,17, que pudesse cumprir um ampla gama de requisitos de pesquisa. Essas propriedades revelaram capacidade potencial do hydrogel ser um injetável várias transportadoras para drogas e células em ambos in vitro e em vivo pesquisa biomédica e aplicações.
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Protocol
atenção: favor consultar todas as fichas de dados de segurança (MSDS) antes do uso. Por favor, use as práticas de segurança adequadas ao realizar experimentos de química, incluindo o uso de uma coifa e equipamento de protecção pessoal (óculos de segurança, luvas de proteção, jaleco, etc.). O protocolo exige célula padrão manipulação técnicas (esterilização, recuperação da célula, célula passagem, congelamento de célula, coloracao celular, etc).
1. preparação do hidrogel
- síntese do benzaldeído finalizado di-acrescida de polietileno glicol (PEG DF)
- pré-dessecação de PEG polímero
- pesar 4,00 g PEG (4.000 MW, 1.00 mmol), transferir para um balão de fundo redondo (250 mL) e adicionar tolueno (100 mL).
Nota: Outras PEGs com diferentes pesos moleculares pode trabalhar para a formação de hidrogel, mas levará a rigidez diferente. - Aquecer a solução por uma pistola de calor (ou um prato quente em torno de 40 ° C) ligeiramente para ajudar a dissolver todos os polímeros. Depois de dissolvem todos os polímeros, use um evaporador para remover todos os solventes. Repita esse processo seco e dissolver duas vezes tornar o PEG secado polímeros.
Atenção: Esta deve ser executada em uma coifa com extremo cuidado. Tolueno é inflamável.
- pesar 4,00 g PEG (4.000 MW, 1.00 mmol), transferir para um balão de fundo redondo (250 mL) e adicionar tolueno (100 mL).
- Reação de terminação benzaldeído de PEG
- Adicionar um agitador magnético e tetrahidrofurano (THF, 100 mL) no balão e dissolver PEG, utilizando um agitador. Adicionar 4-carboxybenzaldehyde (0,90 g, 6,0 mmol) e 4-dimetilaminopiridina (0,07 g, 0,6 mmol) em sequência para as soluções para dissolver todos os sólidos completamente.
- Add N, N '-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 1,25 g, 6,0 mmol) para a solução e adicionar um tubo de secagem que é preenchido com anidro CaCl 2 para o balão. Manter a reação sob agitação à temperatura ambiente (~ 20 ° C) por cerca de 12 h.
- Processo de pós-reação
- filtrar os sólidos brancos gerados na solução por vácuo, depois que a reação é terminada. Despeje a solução em éter dietílico frio (500 mL) sob agitação para precipitar os sólidos brancos. Reunir todos os sólidos brancos pelo filtro e seque os sólidos em uma coifa.
- Dissolver os sólidos brancos em THF novamente, filtrar qualquer sólidos insolúveis brancos, despeje a solução de éter dietílico frio fresco para precipitar os sólidos brancos e secá-lo. Repita este processo de duas a três vezes e em seguida, coloque os sólidos brancos em um forno de secagem a vácuo (20 ° C, 0.1 mbar) para secá-los completamente. Recolher o pó branco como o produto final: benzaldeído finalizado PEG DF.
- pré-dessecação de PEG polímero
- Preparação do hidrogel
- pesar quantidades diferentes de PEG DF (0,11 g, 0,028 mmol g 0,22, 0.055 mmol; 0,44 g, 0.110 mmol) em um tubo (10 mL), adicionar água desionizada (5,0 mL) e use um vórtice ou agitador magnético para ajudar dissolver o polímero.
- Dissolver glicol quitosana (0,495 g, 6.18 x 10 -3 mmol) em água desionizada (15,0 mL) em um tubo (50 mL) e usar um vórtice por alguns minutos para homogeneizar a solução de quitosana (3% em peso).
- Adicionar a solução de quitosana glicol (0,2 mL, 3% em peso) e soluções DF PEG (0,2 mL) sequencialmente em um tubo (2,0 mL). Use um vórtice para misturar as soluções homogênea de hidrogel forma em vários minutos. Siga as proporções na tabela 1 tornar hidrogel de forças mecânicas diferentes.
Nota: Use o método do tubo-invertendo para determinar se o hidrogel já formou.
- Análises de reologia
- efectuar análises de reologia em um rheometer rotatória com uma placa de aço paralela (diâmetro: 20 mm). Para o teste de gelificação, espalhe o glicol solução de quitosana (0,2 mL, 3% em peso) em uma placa inferior. Em seguida, adicionar DF PEG soluções aquosas (0,2 mL, 2% em peso) gota uniformemente sobre a superfície da solução de quitosana e misture rapidamente com uma pipeta. Abaixe a placa superior e iniciar para teste
- De hidrogel ' s teste de rigidez, cortar um círculo um hidrogel (diâmetro: 20 mm) e medir o módulo de armazenamento (G ') valores contra as análises de frequência na estirpe de 1%. G típico ' valores a 6,3 rad s − 1 estão listados na tabela 1.
Nota: Efectuar as análises de reologia do hidrogel 0,5 h após a formação de hidrogel para assegurar a estabilização de vínculo dinâmico do hidrogel. - Para o hidrogel ' s auto reparáveis Propriedade testar, cortar um hidrogel em pedaços e juntar os pedaços de auto-recuperação de uma peça integrante. Em seguida, corte a peça de hidrogel para fazer um círculo (diâmetro: 20 mm) e colocá-lo sobre o rheometer para realizar a análise de reologia.
2. cultivo de célula 3D em hidrogel
- preparação de soluções de gelificação de hidrogel
- pesar DF PEG (0,44 g, 0.11 mmol) em um tubo estéril (4,0 mL), adicionar em meios de cultura celular (RPMI-1640, 2.0 mL) e usar um vórtice ou agitador para ajudar a dissolver o polímero para obter a solução de polímero (20% em peso). Carregar a solução em uma seringa (10,0 mL) e então ele esterilizar por passagem através de um filtro de bactérias-retentiva mícron (0,22 µm).
- Pesar a quitosana de glicol (0,165 g, 2,06 x 10 -3 mmol) em um tubo estéril (15,0 mL), adicionar em meios de cultura celular (RPMI-1640, 4,0 mL) e o vórtice para ajudar a dissolver o polímero para obter a solução de quitosana glicol (4,0% em peso). Carregar a solução em uma seringa (10,0 mL) e filtrá-la com um filtro de 0,22 µm bactérias-retentiva.
- Cultivo celular em hidrogel
atenção: executar todos os procedimentos relacionados em uma capa de cultura de tecidos de células. Conhecimentos básicos de técnica estéril é esperado.- Preparação da suspensão de células
- células L929 cultura RPMI-1640, suplementado com 10% FBS, 5% de penicilina (10 mL) em uma Petri prato (diâmetro 10 cm) e incubar a 37 ° C, 5% de CO 2. Mudar o meio todos os dias antes de usar.
- Colher as células L929 com PBS contendo tripsina (0,025% do w/v) e EDTA (0,01% w/v), centrifugar (70 x g, 5 min) e ressuspender as células em meio RPMI-1640 (1,0 mL). Realize a contagem de células usando a operação padrão da placa de contagem de sangue. Ressuspender as células para ajustar a concentração de células para ~ 3,75 × 10 6 células/mL.
- Encapsulamento de célula em hidrogel
- misturar as suspensões de células L929 (0,4 mL, 3,75 x 10 6 células mL -1) com solução de quitosana glicol (0,4 mL) em um tubo (4,0 mL) pelo vórtice. Pipetar a solução de quitosana L929/glicol (0,8 mL) para o centro de um prato de Petri confocal (diâmetro 2,0 cm). Pipetar as DF PEG soluções (0,2 mL) para o mesmo prato e pipetar delicadamente para misturar a solução e induzir a formação de hidrogel.
Nota: Avaliar a formação de hidrogel inclinando o prato de petri. - Para cultura de células direta, adicionar quantidades adicionais de meios de cultura RPMI-1640 (1,0 mL) em cima do hidrogel. Colocar a célula incorporada hidrogel (1,0 mL, 1.5 wt % glicol quitosana, 4,0 wt % DF PEG, 1,5 × 10 6 células mL -1) em uma incubadora (37 ° C, 5% CO 2) e altere o meio todos os dias. Prepare-se para a imagem latente de célula no dia 1, 3, 5 e 7 após encapsulamento celular.
- misturar as suspensões de células L929 (0,4 mL, 3,75 x 10 6 células mL -1) com solução de quitosana glicol (0,4 mL) em um tubo (4,0 mL) pelo vórtice. Pipetar a solução de quitosana L929/glicol (0,8 mL) para o centro de um prato de Petri confocal (diâmetro 2,0 cm). Pipetar as DF PEG soluções (0,2 mL) para o mesmo prato e pipetar delicadamente para misturar a solução e induzir a formação de hidrogel.
- Para a pós-cultura de células 3D em hidrogel após a injeção, preparar celular carregado hidrogel (1,0 mL, consulte a etapa 2.2.2) numa seringa (10,0 mL, agulha 48 G). Após as formas de hidrogel, injetar o hidrogel lentamente em uma placa de Petri para a imagem latente confocal. Adicionar um montante adicional de meios de cultura (1,0 mL) em cima do hidrogel e alterá-lo todos os dias. Coloque o prato de Petri em uma incubadora (37 ° C, 5% CO 2) e prepare-se para a imagem latente depois.
Atenção: Verifique e seguir o protocolo de operação de segurança de uma seringa.
- Preparação da suspensão de células
- Análise de viabilidade de células
- Confocal observação
- Enxaguar o hidrogel com PBS (1,0 mL) por duas vezes. Mancha o hidrogel com diacetato de fluoresceína (FDA, 0,5 mL, 0,05 mg/mL) e soluções de propidium iodeto (PI, 0,5 mL, 0,08 mg/mL) por 15 min. Depois da coloração, remover todos os solventes.
- Observar o hidrogel usando um microscópio confocal em comprimentos de onda de excitação de 488 nm e 543 nm a visualização ao vivo e mortos células, respectivamente. Leva pilhas através de cada profundidade de 2 µm do hidrogel para validar uma distribuição uniforme de células ao longo de z.
Nota: FDA manchas de células vivas enquanto PI manchas de células mortas.
- Degradar o hidrogel (1,0 mL) com ácido acético (HAc, 3% de v, 1,0 mL) por 5 min e pipetar para um tubo (4,0 mL). Coletar as células por centrifugação (70 x g, 5 min) e ressuspender as células em meio de cultura RPMI 1640 celular (1,0 mL). Executar célula contagem usando um sangue contagem placa.
- Confocal observação
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Representative Results
Uma apresentação esquemática do presente protocolo na preparação do hidrogel e seu uso como cultura de células 3D é oferecida na Figura 1. Informações do hidrogel conteúdo e rácios, preparados com diferentes forças mecânicas estão resumidas na tabela 1. O hidrogel é auto reparáveis e reologia Propriedade apresenta rigidez do hidrogel por módulo de armazenamento versus teste de frequência na Figura 2. As imagens confocal de célula e números de telemóvel com dias de cultura em hidrogel são apresentados na Figura 3, confirmando a viabilidade celular e a proliferação celular através de cultura de células 3D. A Figura 4 apresenta a microscopia confocal imagens e análise das taxas de proliferação celular por células incorporado em hidrogel que sofreu a injeção e pós-cultura. Viabilidade celular alta e proliferação celular indicam que as células incorporadas no hidrogel não sofreram nenhum dano destrutivo e poderiam recuperar por pós-cultura, indicando Injectabilidade do hidrogel.
Figura 1 : Preparação do hidrogel e seu uso como cultura de células 3D. (A) preparação do hidrogel; (B) célula preparação de suspensão; (C) cultura de células 3D em hidrogel com ou sem injeção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Rigidez hidrogel. Módulo de armazenamento G' versus frequência do (A) original e (B) auto curado hidrogel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Cultura de células 3D no hidrogel. (A) imagens confocal 3D de células L929 incorporado na força dura hidrogel (verde: viver células; Vermelho: células mortas); (B) célula contando resultados de células L929 incorporado o hidrogel depois de encapsulamento de célula denotado por hora. Barra de escala = 300 µm. dados apresentados como média ± DP. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : 3D celular pós-cultura em hidrogel após a injeção. (A), A imagem esquemática da injeção e pós-cultura um hidrogel de célula-carregado. Inserção: Imagens de microscopia de células incorporado em hidrogel antes da injeção (à esquerda) e depois pós-cultura de células para 7 dias (meio e direita). Barra de escala = 100 µm; (B) imagens Confocal de células L929 incorporado em um hidrogel de força rígida e pós-culto após a injeção (verde: viver células; Vermelho: células mortas), barra de escala = 300 µm; (C) A comparação entre a taxa de proliferação de células cultivadas em hidrogel com ou sem injeção depois de encapsulamento. Dados apresentados como média ± DP. (adaptado de referência12; Copyright © 2017 Elsevier). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Rigidez de hidrogel | Suave | Médio | Cadáver |
| Quitosana de glicol (mg) | 6.6 | 6.6 | 6.6 |
| DF PEG (mg) | 4.4 | 8.8 | 17,6 |
| Teor de gelator de polímero (% em peso) | 1 | 2 | 4 |
| Água desionizada (mL) | 0.4 | 0.4 | 0.4 |
| Gelaion tempo (min) | 7.5 | 5 | 3.5 |
| G' (Pa)* | 900 | 2100 | 4700 |
| * testado sob frequência 6,3 rad s-1, tensão a 1% usando uma placa paralela (diâmetro 20mm) sobre um rheometer rotacional. |
Tabela 1: Informações de hidrogel preparados com diferentes forças mecânicas.
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Discussion
O hidrogel apresentado neste protocolo (Figura 1) tem dois componentes principais: a polímero natural quitosana de glicol e um sintético benzaldeído encerrado gelator polímero PEG do DF, que são ambos os materiais biocompatíveis. Síntese do DF PEG é apresentado utilizando uma reação de modificação de uma etapa. PEG, de peso molecular 4.000 foi escolhida no presente protocolo em preocupações de solubilidade, eficiência de modificação, bem como rigidez de hidrogel. Uma série de hidrogel com diferentes forças mecânicas foram preparadas usando diferentes índices contínuos e rácios de glicol quitosana e DF PEG. Hidrogel homogênea rapidamente foram formadas em minutos pela mistura de soluções de gelificação sob temperatura ambiente, embora a velocidade de gelificação também poderia abrandar por soluções diluídas. Foi utilizado o teste de reologia para avaliar as forças mecânicas de hidrogel diferentes. O módulo de armazenamento (G') de hidrogel esses foram encontrados aproximadamente difiram dos 900 Pa (soft), 2.100 Pa (médio) para 4.700 Pa (duro) (tabela 1 e Figura 2A). Isto contribuiu para a maior densidade de reticulação, adicionando mais gelators de polímero na rede de hidrogel, resultando em maior módulo de armazenamento (maior rigidez). A propriedade auto reparáveis é igualmente confirmada pela recuperação do módulo do hidrogel (Figura 2B). Sabe-se que a rigidez de ECM é diferente para vários tecidos, assim o hidrogel pode oferecer pistas mecânicas ajustáveis e atender às necessidades de diferentes pesquisas por variadas razões entre glicol quitosana e DF PEG polímero gelators18.
Células L929, uma linhagem de células de fibroblastos típicos do mouse na vivo rigidez de tecido de ambiente de ~ 5.600 pa19, foi usado como um modelo de célula para ser incorporado no hidrogel. Após o encapsulamento de célula em hidrogel, pode ser facilmente observado que as células no hidrogel mostraram viabilidade extremamente alta (> 99%) durante todo o processo de cultura, confirmando a excelente biocompatibilidade do hidrogel baseado em quitosana. Um notável aumento da densidade celular no hidrogel implícito que este hidrogel pode apoiar a proliferação das células L929 mesmo sem fatores de crescimento extra-adicionado (Figura 3A). Após 7 dias em cultura no hidrogel, o número de células aumentou 300% (Figura 3B). É relatado que as células cultivadas em andaimes poderiam diferenciar seguindo pistas mecânicas20,,21, que pode implicar uma pesquisa mais adicional usando esse método de cultura de hidrogel 3D.
Implantação de células com hidrogel injetável ganhou vantagens incomparáveis para aumentar consideravelmente a eficiência de entrega e a viabilidade das células implantados14. Dentro de uma rede de quitosana imina dinâmico, o hidrogel pode auto-recuperação após a injeção. O auto reparáveis propriedade permite que o hidrogel ser injetável, que implica potenciais aplicações para o hidrogel como injetável várias transportadoras. Para avaliar mais este hidrogel como um portador de célula injetável, realizou-se um experimento simulando a injeção e pós-cultivo. O hidrogel de célula incorporada foi carregado em uma seringa e espremido para fora através de uma agulha de 48 G em uma placa de Petri, seguido por um dia 7 pós-cultivo processo com taxa de viabilidade e proliferação de célula estudada.
Como indicado na Figura 4A, as peças de hidrogel squished poderiam auto-restauração para reformar um hidrogel integrado cerca de 1h depois da injeção, que é útil na entrega de célula. Para as células o hidrogel, quando comparado com a imagem levou apenas depois de encapsulamento (Figura 4A, inserir à esquerda), a densidade celular aumentada drasticamente após 7 dias (Figura 4A, inserção média). Na visão alargada, uma mais detalhada célula-fissão processo no qual algumas células são encontradas para ser dividido em dois (Figura 4A, inserir certo), diretamente confirmada pela proliferação celular 3D no hidrogel. Figura 4B mostra as imagens confocal dos ensaios morto-vivo celular após injeção e pós-cultura experimento. A densidade das células injetadas obviamente aumentada com uma viabilidade celular alta (> 99%), demonstrando a proliferação de célula bem sucedido no hidrogel 3D após a injeção. Para saber que se a injeção afetou a taxa de proliferação celular, uma comparação de análise quantitativa de estatísticas para as taxas de proliferação celular em hidrogel com ou sem injeção foi realizada (Figura 4). A taxa de proliferação celular após a injeção, embora ligeiramente diminuído, permaneceu em um nível alto (~ 75%) e o número de células aumentaram 145% relativamente após 7 dias em cultura em hidrogel, indicando que a força de cisalhamento durante a injeção tem um observável limitada influência negativa sobre a proliferação celular.
Descrevemos um procedimento típico desta aplicação de hidrogel mas pesquisadores podem modificar o protocolo para atender necessidades específicas de investigação. Gelators do polímero têm influências significativas sobre o hidrogel e são facilmente modificáveis. Por exemplo, a rigidez deste hidrogel pode ser facilmente manipulada por diferentes proporções de glicol quitosana e gelator DF PEG. Entretanto, o uso de PEG DF de outros pesos moleculares também pudesse cumprir esse destino. Nós usamos o PEG 4K no presente protocolo, mas PEG 2K a 10K pode não funcionar. Ao usar outras PEGs, é importante controlar o tempo da gelificação e rigidez especificamente. Outros gelators de polímero funcional também podem funcionar se os pesquisadores tem habilidades de síntese para preparar específico polímeros funcionais benzaldeído terminada17.
Este protocolo tem várias limitações. Em primeiro lugar, devido à estrutura dinâmica, a rigidez deste hidrogel é limitada em comparação com um hidrogel de ligação cruzada covalente. Possam surgir falhas para preparar hidrogel com muito alta de um projeto de módulo de elasticidade. Em segundo lugar, este hidrogel é biodegradável, limitando assim a cultura de células a longo prazo dentro de hidrogel. Em terceiro lugar, o hidrogel oferece um ambiente de cultivo de quitosana 3D que tem preocupações de difusão. Até à data, a maioria das bio-análises baseiam-se na cultura 2D. A estrutura 3D pode dificultar a célula mais relacionados com estudos in vivo.
Ao usar este protocolo, existem várias etapas essenciais a seguir. Em primeiro lugar, durante a síntese de gelator o polímero PEG do DF, a desidratação é muito importante. Em segundo lugar, ao executar procedimentos relacionados à célula, operação estéril é crítica. Em terceiro lugar, o tempo de coloração deve ser bem controlado no hidrogel para obter belas imagens confocal.
Em resumo, o protocolo introduziu uma preparação superficial de hidrogel injetável à base de quitosana, que é aplicados como uma plataforma para cultura de células 3D e poderia oferecer pistas mecânicas ajustáveis para várias pesquisas. Já foi aplicado em áreas sobre a entrega da droga, terapia celular e quimioterapia tumor, que não só é uma prova de seu desempenho, mas também aumenta o seu potencial para biomédicos applications.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo National Science Foundation da China (21474057 e 21604076).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycol chitosan | Wako Pure Chemical Industries | 39280-86-9 | 90% degree of deacetylation |
| 4-Carboxybenzaldehyde | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 619-66-9 | 99% |
| N, N'-dicyclohexylcarbodiimide | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 538-75-0 | 99% |
| Calcium chloride anhydrous | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 10043-52-4 | 96% |
| 4-dimethylamiopryidine | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 1122-58 | 99% |
| Polyethyleneglycol | Sino-pharm Chemical Reagent | 5254-43-7 | 99% |
| Tetrahydrofuran | Sino-pharm Chemical Reagent | 109-99-9 | 99% |
| Toluene | Sino-pharm Chemical Reagent | 108-88-3 | 99% |
| Ethyl ether | Sino-pharm Chemical Reagent | 60-29-7 | 99% |
| Acetic acid | Sino-pharm Chemical Reagent | 64-19-7 | 99% |
| Anhydrous CaCl2 | Sino-pharm Chemical Reagent | 10043-52-4 | 99% |
| Fluorescein diacetate | Sigma | 596-09-8 | 99% |
| Propidium iodide | Sigma | 25535-16-4 | 94% |
| RPMI-1640 culture media | Gibco | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | ||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 0.25% | |
| PBS | Solarbio | 0.01 M | |
| Penicillin streptomycin solution | Hyclone | 10,000 U/mL | |
| Rheometer | TA Instrument | AR-G2 | |
| Confocal microscope | Zeiss | 710-3channel | |
| L929 Cells | ATCC | NCTC clone 929; L cell, L929, derivative of Strain L | |
| Evaporator | EYELA | N-1100 | |
| 48 guage needle | ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD | 48-guage | |
| Microscope | Leica | DM3000 B | |
| Microscope software | Imaris | ||
| Heat gun | Confu | KF-5843 | |
| Petri dish | NEST |
References
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