Voorbereiding van injecteerbare Hydrogels Chitosan gebaseerde en de toepassing ervan in de 3D-celkweek
Summary
Hier beschrijven we een facile voorbereiding van chitosan gebaseerde injecteerbare hydrogels met behulp van dynamische imine chemie. Methoden om aan te passen van de hydrogel mechanische sterkte en de toepassing ervan in de 3D-celkweek worden gepresenteerd.
Abstract
Het protocol presenteert een facile, efficiënte en veelzijdige methode ter voorbereiding van de chitosan gebaseerde hydrogels met behulp van dynamische imine chemie. De hydrogel is bereid door oplossingen van glycol chitosan mengen met een gesynthetiseerde benzaldehyde beëindigd polymeer gelator en hydrogels efficiënt in enkele minuten bij kamertemperatuur worden verkregen. Door verschillende verhoudingen tussen glycol chitosan, polymeer gelator en water inhoud, zijn veelzijdige hydrogels met verschillende gelering tijden en stijfheid verkregen. Wanneer beschadigd zijn, kan de hydrogel zijn optredens en modulus, als gevolg van de omkeerbaarheid van de dynamische imine obligaties als crosslinkages terugkrijgen. Deze zelfstandige healable eigenschap kunt de hydrogel als injecteerbare omdat het zichzelf genezen van geperste stukken aan een integraal bulk hydrogel na de injectie proces worden kan. De hydrogel is ook multi inspelen op veel bio-actieve prikkels als gevolg van verschillende evenwichtsinstelling statussen van de dynamische imine obligaties. Deze hydrogel werd bevestigd als bio-compatibel, en L929 muis fibroblast cellen waren ingesloten volgende standaardprocedures en de celproliferatie was gemakkelijk beoordeeld door een kweekproces 3D cel. De hydrogel kan bieden een verstelbare platform voor verschillende onderzoek waar een fysiologische nabootsen van een 3D-omgeving voor cellen is geprofiteerd. Samen met haar multi responsieve, zelf healable en injecteerbare eigenschappen, de hydrogels potentieel toepasbaar als meerdere dragers voor drugs en cellen in toekomstige bio-medische toepassingen.
Introduction
Hydrogels zijn kruisverwijzende polymeermaterialen met grote hoeveelheden water en zachte mechanische eigenschappen, en zij zijn gebruikt in vele toepassingen van de bio-medische1,2. Hydrogels kan bieden een zachte en natte omgeving, die zeer vergelijkbaar met de fysiologische omgeving voor cellen in vivo is. Daarom, hydrogels uitgegroeid tot een van de meest populaire steigers voor 3D cel cultuur3,4. Vergeleken met de cultuur van de cel van de petrischaal 2D, 3D-celkweek beschikt over geavanceerde snel om aan te bieden dat een extracellulaire matrix (ECM) geïmiteerd communicatie voor cellen te contacteren en te assembleren voor de proliferatie en differentiatie doeleinden5. Daarnaast kon hydrogels die natuurlijke polymeren bevatten bio-compatibel en bevordering van omgevingen voor cellen vermenigvuldigen en onderscheiden3bieden. Hydrogels afgeleid van synthetische polymeren hebben de voorkeur voor hun eenvoudige en duidelijke onderdelen, welke uitsluiten van complexe invloeden zoals eiwitten van dierlijke oorsprong of virussen. Hydrogels die gemakkelijk worden voorbereid en hebben een consistente eigenschap hebben onder alle hydrogel kandidaten voor 3D-celkweek, altijd de voorkeur. De faciliteit aan te passen van de hydrogel eigenschappen aanpassen aan verschillende onderzoek eisen is belangrijk als goed6.
Hier introduceren we een facile voorbereiding van een glycol chitosan gebaseerde hydrogel met behulp van dynamische imine chemie, die een veelzijdige hydrogel platform voor 3D cel cultuur7wordt. Bij deze methode worden bekende bio-compatibele glycol chitosan gebruikt om frames van de hydrogel van netwerken. De amino groepen zijn reageerde met een polyethyleenglycol benzaldehyde beëindigd als het polymeer gelator dynamische imine obligaties vormen als crosslinkages van hydrogels8. Dynamische imine obligaties kunnen vormen en ontleden omkeerbaar en servicegerichte omgeving, waarmee de hydrogels met mechanisch verstelbare kruisverwijzende netwerken9,10,11. Vanwege de hoge water inhoud, bio-compatibele materialen, en instelbare mechanische krachten, is de hydrogel met succes toegepast als een steiger voor L929 cellen in 3D cel cultuur12,13. Het protocol hier een overzicht van de procedures, met inbegrip van polymeer gelator synthese, hydrogel voorbereiding cel insluiten en 3D cel kweken.
De hydrogel toont ook verschillende andere functies als gevolg van de dynamische imine-crosslinkages, met inbegrip van haar multi inspelen op verschillende bio-stimuli (zuur/pH, vitamine B6 afgeleide pyridoxal, eiwit papaïne, enz.), wat erop duidt dat de hydrogel kon worden geïnduceerde te ontleden onder fysiologische omstandigheden8. De hydrogel is ook zelf healable en injecteerbare, wat betekent de hydrogel kan worden beheerd via een minimaal invasieve injectie-methode en een voordeel in drugs- en cel leveringen14,15. Door toevoeging van functionele additieven of specifieke vooraf ontworpen polymeer gelators, de hydrogel compatible bij het verkrijgen van specifieke eigenschappen zoals magnetische, temperatuur, pH responsieve, etc.16,17, die kan voldoen aan een breed scala van onderzoek eisen. Deze eigenschappen onthullen de potentiële capaciteit van de hydrogel als een injectable meerdere vervoerders voor drugs en cellen in zowel in vitro en in vivo biomedisch onderzoek en toepassingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hydrogel gepresenteerd in dit protocol (Figuur 1) bestaat uit twee hoofdonderdelen: de natuurlijke polymeer glycol chitosan en een synthetische benzaldehyde beëindigd polymeer gelator DF PEG, die beide biocompatibel materiaal. Synthese van DF PEG wordt gepresenteerd met behulp van een one-step wijziging reactie. PEG met molecuulgewicht 4.000 werd gekozen in dit protocol in de zorgen van de oplosbaarheid, wijziging efficiëntie, evenals hydrogel stijfheid. Een aantal hydrogels met verschi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door de National Science Foundation of China (21474057 en 21604076).
Materials
| Glycol chitosan | Wako Pure Chemical Industries | 39280-86-9 | 90% degree of deacetylation |
| 4-Carboxybenzaldehyde | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 619-66-9 | 99% |
| N, N'-dicyclohexylcarbodiimide | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 538-75-0 | 99% |
| Calcium chloride anhydrous | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 10043-52-4 | 96% |
| 4-dimethylamiopryidine | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 1122-58 | 99% |
| Polyethyleneglycol | Sino-pharm Chemical Reagent | 5254-43-7 | 99% |
| Tetrahydrofuran | Sino-pharm Chemical Reagent | 109-99-9 | 99% |
| Toluene | Sino-pharm Chemical Reagent | 108-88-3 | 99% |
| Ethyl ether | Sino-pharm Chemical Reagent | 60-29-7 | 99% |
| Acetic acid | Sino-pharm Chemical Reagent | 64-19-7 | 99% |
| Anhydrous CaCl2 | Sino-pharm Chemical Reagent | 10043-52-4 | 99% |
| Fluorescein diacetate | Sigma | 596-09-8 | 99% |
| Propidium iodide | Sigma | 25535-16-4 | 94% |
| RPMI-1640 culture media | Gibco | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | ||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 0.25% | |
| PBS | Solarbio | 0.01 M | |
| Penicillin streptomycin solution | Hyclone | 10,000 U/mL | |
| Rheometer | TA Instrument | AR-G2 | |
| Confocal microscope | Zeiss | 710-3channel | |
| L929 Cells | ATCC | NCTC clone 929; L cell, L929, derivative of Strain L | |
| Evaporator | EYELA | N-1100 | |
| 48 guage needle | ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD | 48-guage | |
| Microscope | Leica | DM3000 B | |
| Microscope software | Imaris | ||
| Heat gun | Confu | KF-5843 | |
| Petri dish | NEST |
References
- Hoffman, A. S. Hydrogels for biomedical applications. Adv. Drug. Deliver. Rev. 64, 18-23 (2012).
- Seliktar, D. Designing cell-compatible hydrogels for biomedical applications. Science. 336 (6085), 1124-1128 (2012).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (115), (2016).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. 3D Cell Culture: Methods and Protocols. , 1-15 (2011).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug. Discov. Today. 18 (5), 240-249 (2013).
- Yang, B., et al. Facilely prepared inexpensive and biocompatible self-healing hydrogel: a new injectable cell therapy carrier. Polym. Chem. 3 (12), 3235-3238 (2012).
- Zhang, Y., Tao, L., Li, S., Wei, Y. Synthesis of multiresponsive and dynamic chitosan-based hydrogels for controlled release of bioactive molecules. Biomacromolecules. 12 (8), 2894-2901 (2011).
- Cao, L., et al. An injectable hydrogel formed by in situ cross-linking of glycol chitosan and multi-benzaldehyde functionalized PEG analogues for cartilage tissue engineering. J. Mater. Chem. B. 3 (7), 1268-1280 (2015).
- Ding, F., et al. A dynamic and self-crosslinked polysaccharide hydrogel with autonomous self-healing ability. Soft Matter. 11 (20), 3971-3976 (2015).
- Wei, Z., et al. Self-healing gels based on constitutional dynamic chemistry and their potential applications. Chem. Soc. Rev. 43 (23), 8114-8131 (2014).
- Li, Y., et al. Modulus-regulated 3D-cell proliferation in an injectable self-healing hydrogel. Colloid. Surface. B. 149, 168-173 (2017).
- Tseng, T. C., et al. An Injectable, Self‐Healing Hydrogel to Repair the Central Nervous System. Adv. Mater. 27 (23), 3518-3524 (2015).
- Yu, L., Ding, J. Injectable hydrogels as unique biomedical materials. Chem. Soc. Rev. 37 (8), 1473-1481 (2008).
- Yang, L., et al. Improving Tumor Chemotherapy Effect by Using an Injectable Self-healing Hydrogel as Drug Carrier. Polym. Chem. , (2017).
- Zhang, Y., et al. A magnetic self-healing hydrogel. Chem. Commun. 48 (74), 9305-9307 (2012).
- Zhang, Y., et al. Synthesis of an injectable, self-healable and dual responsive hydrogel for drug delivery and 3D cell cultivation. Polym. Chem. 8 (3), 537-534 (2017).
- Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat. Mater. 13 (6), 645-652 (2014).
- Geerligs, M., Peters, G. W., Ackermans, P. A., Oomens, C. W., Baaijens, F. Linear viscoelastic behavior of subcutaneous adipose tissue. Biorheology. 45 (6), 677-688 (2008).
- Banerjee, A., et al. The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells. Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).
- Benoit, D. S., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).
