Un metodo per valutare le funzioni effettrici Fc-mediata indotte dagli anticorpi specifici di Hemagglutinin di riossidazione
Summary
Descriviamo un metodo per misurare l’attivazione di funzioni effettrici Fc-mediata dagli anticorpi che hanno come destinazione l’emagglutinina del virus dell’influenza. Questo dosaggio può essere adattato anche per valutare la capacità di anticorpi monoclonali o policlonali sieri altre glicoproteine di superficie virale di targeting di indurre immunità Fc.
Abstract
Gli anticorpi svolgono un ruolo cruciale nell’accoppiamento la risposta immunitaria innata e adattativa contro gli agenti patogeni virali attraverso i loro domini di legame dell’antigene e Fc-regioni. Qui, descriviamo come misurare l’attivazione di Fc funzioni effettrici dagli anticorpi monoclonali targeting l’emoagglutinina di virus dell’influenza con l’uso di una linea di cellule Jurkat geneticamente esprimendo un’attivazione digitare 1 Fc-FcγR. utilizzando questo metodo, la contributo delle specifiche interazioni Fc-FcγR conferito dalle immunoglobuline può essere determinata usando un’analisi in vitro .
Introduction
Immunità prevista dal vaccino influenzale stagionale tradizionalmente è stata valutata dal emoagglutinazione inibizione (HI) analisi1, che misura la presenza di anticorpi che il sito di legame del recettore del hemagglutinin di destinazione. Questi anticorpi HI-attivo possono conferire immunità sterilizzante, ma sono generalmente stretti nella loro ampiezza di protezione, fornire l’immunità per solo un selezionare alcuni ceppi del virus dell’influenza. L’isolamento e la caratterizzazione di largamente reattivi anticorpi monoclonali che riconoscono l’emoagglutinina (HA) suggerire che lo sviluppo di un vaccino antinfluenzale universale è a portata di mano2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8. uno degli obiettivi principali di un vaccino antinfluenzale universale è quello di indurre una risposta anticorpale forte verso le regioni conservate del virus influenzale9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16. in linea di massima gli anticorpi reattivi che riconoscono questi epitopi conservati, composto di neutralizzazione e non neutralizzando gli anticorpi17,18, hanno dimostrati di richiedono interazioni Fc-FcγR per ottimale protezione in vivo ed evidenziare il contributo di immunità Fc per la complessiva risposta immunitaria al virus influenzale19,20.
Componenti di protezione sono fondamentali per valutare l’immunità all’infezione. Questi indicatori consentono a scienziati e clinici valutare l’efficacia dei vaccini, il significato dei dati e il corso del trattamento. Il solo correlazione stabilito di protezione contro l’infezione da virus influenzale è l’analisi di inibizione di emagglutinazione. Un titolo di 01:40 è associato con una riduzione del 50% del rischio di malattia1,21 – e riflette la presenza di anticorpi che inibiscono agglutinazione prendendo di mira il recettore vincolante sito situato sulla testa globulare della HA. Tuttavia, dovrebbe anche essere notato che le risposte delle cellule T possono essere una componente migliore di protezione contro l’infezione da virus influenzale negli anziani. Interessante, un recente rapporto suggerisce che l’attività di inibizione della neuraminidasi può essere un migliore indicatore di immunità all’influenza22. Fortunatamente, tipico in vitro dosaggi come analisi di inibizione di neutralizzazione o neuraminidasi possono misurare anticorpi specifici del gambo o neuraminidasi HA. La maggior parte di questi saggi convenzionali in vitro , tuttavia, solo prendere in considerazione la funzione della regione di associazione dell’antigene dell’anticorpo e non misurano il ruolo della regione Fc. Inoltre, il contributo degli anticorpi non neutralizzanti che proteggere tramite Fc recettore fidanzamento in vivo non sono rilevati17,18. Al fine di misurare la protezione garantita dagli anticorpi che inducono immunità Fc quali citotossicità di anticorpo dipendente cellulo-mediata (ADCC), è necessaria un’analisi robusta in vitro .
Il metodo descritto di seguito valuta la capacità di anticorpi monoclonali murini di indurre funzioni Fc-mediata attraverso l’uso di una linea di cellule Jurkat geneticamente esprimendo un’attivazione murino digitare 1 FcR, FcγRIV. Impegno di anticorpo del FcγR trasduce quel fattore nucleare di trigger di attività luciferasica attivato T-cellule-mediata di segnalazione intracellulare. Il saggio ha diversi vantaggi rispetto alle tecniche tradizionali che richiedono isolamento e coltura di cellule effettrici primarie e l’uso di citometria a flusso per rilevare l’attivazione di funzioni effettrici Fc-mediata19,,23,24 ,25,26. In primo luogo, il protocollo descritto qui può essere facilmente adattato per incorporare diversi bersagli virali, FcγRs e anticorpi appartenenti a specie diverse (umane e murine). In secondo luogo, l’uso di una modifica per la cella di Jurkat linea esprimendo un FcγR con un gene reporter luciferasi sotto un fattore nucleare delle cellule T attivate (NFAT) consente per un saggio di grande formato che possa essere facilmente analizzato utilizzando un lettore di luminescenza di misura. Qui, l’attivazione tradizionale di cellule effettrici primario viene sostituito con l’induzione di NFAT-luciferasi all’impegno dell’anticorpo di un FcγR sulla superficie della cellula Jurkat. Questo test di formato piastra a 96 pozzetti consente la misurazione di fino a quattro diversi campioni in triplici copie con sette diluizioni – un numero di campioni che potrebbe essere ingombrante usando le tecniche tradizionali. Ci sono ulteriori punti da considerare con questo test che può influenzare la progettazione di esperimenti e l’interpretazione dei dati. Il bersaglio virale deve essere espresso sulla superficie delle cellule in ordine per riconoscimento anticorpale. Per ovviare a questo inconveniente, l’antigene bersaglio (ad es. una proteina virale interna) può essere rivestito direttamente sulla superficie di una piastra. Tuttavia, questo non è ancora stato rigorosamente testato. Inoltre, la modifica per la linea cellulare Jurkat esprime un solo tipo di attivazione FcγR e non esprime alcun FcγRs inibitorio, mentre linee cellulari primarie esprimono tutti i recettori in un contesto fisiologico.
Precedentemente abbiamo usato questo test per dimostrare che l’epitopo specificità in un contesto policlonale svolge un ruolo cruciale nella regolazione di funzioni effettrici Fc-mediata e che l’attivazione ottimale della risposta cellulo-mediata anticorpo-dipendente richiede due punti di Contattare27,28. Qui, descriviamo un metodo che valuta la capacità degli anticorpi monoclonali specifici del gambo per coinvolgere e attivare murino attivazione FcγRIV. Anche se ci sono eccezioni29,30, un gran numero di anticorpi reattivi largamente la regione gambo antigenicamente conservata del hemagglutinin di destinazione e quindi gioca un ruolo importante nello sviluppo di una influenza universale vaccino.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo qui descritto consente di misurare la capacità di un anticorpo monoclonale specifico HA per coinvolgere il FcγRIV murino. L’antigene bersaglio, emoagglutinina di virus influenzale, è espresso sulla superficie delle cellule dopo l’infezione da virus o transfezione del DNA del plasmide. Il dosaggio ulteriormente è favorevole all’utilizzo di diverse proteine virali di superficie espressa in combinazione con altri FcγRs (esseri umani o murino). Inoltre, abbiamo utilizzato campioni di siero per valutare la capa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto è stato finanziato in parte con fondi federali dal National Institute of Allergy e malattie infettive, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, sotto CEIRS contratto P01AI097092-04S1 (p.e.l.).
Materials
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-3216 | Human embryonic kidney cells |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | Transfection reagent |
| 1X Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | |
| White tissue culture treated 96-well plate | Corning, Inc. | 3917 | Assay plates |
| 10X MEM | Gibco | 11430-030 | |
| Jurkat cell expressing murine FcgRIV | Promega | M1201 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Jurkat cell expressing human FcgRIIIa | Promega | G7010 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Jurkat cell expressing human FcgRIIa | Promega | G9901 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Luminometer | BioTek | Synergy H1 Multi-Mode reader | Luminescence plate reader |
| Bio-Glo Luciferase Assay System | Promega | G7940 | Contains luciferase assay buffer and luciferase assay substrate |
| Madin Darby canine kidney cells | ATCC | CCL-34 | Canine kidney cells |
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