Un método para evaluar las funciones efectoras mediadas por Fc inducidas por los anticuerpos específicos de la hemaglutinina de la gripe
Summary
Se describe un método para medir la activación de funciones efectoras Fc-mediada por anticuerpos dirigidos la hemaglutinina del virus de la gripe. Este análisis también pueden ser adaptado para evaluar la capacidad de inducir Inmunidad mediada por Fc de anticuerpos monoclonales o sueros policlonales dirigidos a otras glicoproteínas virales de superficie.
Abstract
Los anticuerpos desempeñan un papel crucial en las respuestas inmunes innatas y adaptativas frente a patógenos virales a través de sus dominios de unión a antígeno y las regiones Fc de acoplamiento. Aquí, describimos cómo medir la activación del Fc funciones efectoras de los anticuerpos monoclonales contra la hemaglutinina del virus de influenza con el uso de una línea de células de Jurkat transgénicos expresando una activación tipo 1 Fc-FcγR. utilizando este método, la contribución de interacciones Fc FcγR conferido por las inmunoglobulinas puede ser determinado mediante un ensayo en vitro .
Introduction
Inmunidad proporcionada por la vacuna contra la gripe estacional se ha valorado tradicionalmente por la hemaglutinación inhibición (HI) ensayo1, que mide la presencia de anticuerpos que atacan el sitio de unión del receptor de la hemaglutinina. Estos anticuerpos HI-active pueden conferir inmunidad esterilizante, pero son generalmente limitados en su alcance de protección, inmunidad a sólo seleccionar pocas las cepas de virus de la gripe. El aislamiento y la caracterización de ampliamente reactivos anticuerpos monoclonales que reconocen la hemaglutinina (HA) sugieren que el desarrollo de una vacuna antigripal universal está al alcance2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8. uno de los objetivos principales de una vacuna universal de gripe es inducir una respuesta fuerte de anticuerpos hacia las regiones conservadas del virus de la influenza9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16. ampliamente anticuerpos reactivos que reconocen estos epítopes conservados, compuesto de neutralizante y no neutralizar anticuerpos17,18, han demostrado que requieren interacciones FcγR Fc para óptima protección en vivo y a destacar la contribución de la inmunidad mediada por la Fc a la respuesta inmune a influenza virus19,20.
Correlatos de protección son cruciales para evaluar la inmunidad a la infección. Estas métricas permiten a los científicos y los clínicos estimar la eficacia de las vacunas, la importancia de los datos y el curso del tratamiento. El único correlato establecido de protección contra la infección por virus de la influenza es el ensayo de inhibición de hemaglutinación. Un título de 1:40 se asocia con una reducción del 50% en el riesgo de enfermedad1,21 – y refleja la presencia de anticuerpos que inhiben la aglutinación apuntando el receptor binding sitio ubicado en la cabeza globular de la HA. Sin embargo, también cabe señalar que las respuestas de células T pueden ser un mejor correlato de protección contra la infección por virus influenza en los ancianos. Curiosamente, un informe reciente sugiere que la actividad de inhibición de la neuraminidasa puede ser un mejor predictor de la inmunidad a la influenza22. Afortunadamente, típico en vitro ensayos tales como ensayos de inhibición de neutralización o neuraminidasa pueden medir HA tallo o neuraminidasa-anticuerpos específicos. La mayoría de estos ensayos convencionales en vitro , sin embargo, sólo tener en cuenta la función de la región de unión del antígeno del anticuerpo y no medir el papel de la región Fc. Además, el aporte de anticuerpos no neutralizantes que protegen a través de Fc receptor compromiso en vivo no son detectado17,18. Para medir la protección conferida por los anticuerpos que inducen inmunidad de Fc como citotoxicidad celular dependiente mediada por anticuerpos (ADCC), es necesario un análisis robusto en vitro .
El método se describe a continuación evalúa la capacidad de los anticuerpos monoclonales murinos para inducir funciones Fc-mediada a través de una línea de células de Jurkat transgénica expresando una activación murino tipo 1 FcR, FcγRIV. Participación de anticuerpo de la FcγR transmite señalización intracelular que desencadena nuclear el factor de actividad de luciferasa mediada por células T activadas. El ensayo tiene varias ventajas sobre las técnicas tradicionales que requieren aislamiento y cultivo de células efectoras primarias y el uso de citometría de flujo para detectar la activación de efectores Fc-mediada funciones19,23,24 ,25,26. En primer lugar, el protocolo descrito aquí puede ser fácilmente adaptado para incorporar objetivos virales diferentes, FcγRs y los anticuerpos de diferentes especies (humanas y murinas). En segundo lugar, el uso de un celular Jurkat modificado línea expresando un FcγR con un gen reportero de luciferasa bajo un factor nuclear de células T activadas (NFAT) permite un análisis de gran formato que pueden analizarse fácilmente usando un lector de placas de medición de luminiscencia. Aquí, se sustituye la tradicional activación de células efectoras primarias con la inducción de NFAT luciferasa sobre participación de anticuerpo de un FcγR en la superficie de las células de Jurkat. Este ensayo de placa de 96 pocillos formato permite la medición de hasta cuatro diversas muestras en triplicado con siete diluciones – un número de muestras que podrían ser incómodos usando técnicas tradicionales. Hay puntos adicionales a considerar en este ensayo que pueda afectar el diseño de experimentos y la interpretación de datos. El objetivo del viral debe expresarse en la superficie celular en orden para el reconocimiento de anticuerpos. Para mitigar esto, el antígeno de la blanco (e.g. una proteína viral interna) puede ser cubierto directamente en la superficie de una placa. Sin embargo, esto no ha todavía sido rigurosamente probado. Además, la línea de células de Jurkat modificada expresa sólo un tipo de activación FcγR y no expresa ningún FcγRs inhibitorio, mientras que líneas de células primarias expresan todos los receptores en un contexto fisiológico.
Anteriormente hemos utilizado este test para demostrar que la especificidad del epítopo en un contexto policlonal desempeña un papel crucial en la regulación de funciones efectoras mediadas por el Fc y que activación óptima de la respuesta mediada por células dependiente de anticuerpos requiere de dos puntos de Póngase en contacto con27,28. Aquí, describimos un método que evalúa la capacidad de los anticuerpos monoclonales específicos del tallo de participar y activar el murino activación FcγRIV. Aunque hay excepciones29,30, un gran número de anticuerpos ampliamente reactivos destino la región del tallo antigénicamente conservada de la hemaglutinina y así jugar un papel importante en el desarrollo de una influenza universal vacuna.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método aquí descrito permite al usuario medir la capacidad de un anticuerpo monoclonal de específicos HA de comprometerse FcγRIV murino. El antígeno Diana, hemaglutinina del virus de influenza, se expresa en la superficie de las células después de la infección por virus o transfección del plásmido ADN. El ensayo es más susceptible al uso de diferentes proteínas virales de superficie expresada en combinación con otros FcγRs (seres humanos o murino). Además, hemos utilizado muestras de sueros a evaluar la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto ha sido financiado en parte con fondos federales del Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas, institutos nacionales de salud, Departamento de salud y servicios humanos, bajo CEIRS contrato P01AI097092-04S1 (P.E.L.).
Materials
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-3216 | Human embryonic kidney cells |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | Transfection reagent |
| 1X Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | |
| White tissue culture treated 96-well plate | Corning, Inc. | 3917 | Assay plates |
| 10X MEM | Gibco | 11430-030 | |
| Jurkat cell expressing murine FcgRIV | Promega | M1201 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Jurkat cell expressing human FcgRIIIa | Promega | G7010 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Jurkat cell expressing human FcgRIIa | Promega | G9901 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Luminometer | BioTek | Synergy H1 Multi-Mode reader | Luminescence plate reader |
| Bio-Glo Luciferase Assay System | Promega | G7940 | Contains luciferase assay buffer and luciferase assay substrate |
| Madin Darby canine kidney cells | ATCC | CCL-34 | Canine kidney cells |
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