Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Tillämpning av Laser mikro-bestrålning för undersökning av singel och dubbel Strand paus reparation i däggdjursceller

Published: September 5, 2017 doi: 10.3791/56265
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Oncologic Sciences, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute

Summary

Confocal fluorescence mikroskopi och laser mikro-bestrålning erbjudande verktyg för inducera DNA-skador och övervakning svaret av DNA reparation proteiner i utvalda sub nukleära områden. Denna teknik har betydligt Avancerat vår kunskap om skador identifiering, signalering och rekrytering. Detta manuskript visar dessa tekniker för att undersöka enkel- och Dubbelrum strand paus reparation.

Abstract

Mycket samordnad DNA reparation vägar finns att upptäcka, punktskatt och ersätta skadade DNA-baser och samordna reparation av DNA strand raster. Även molekylärbiologiska tekniker har klargjort struktur, enzymatiska funktioner och kinetik av reparation proteiner finns det fortfarande ett behov av att förstå hur reparation är samordnad inom kärnan. Laser mikro-bestrålning erbjuder ett kraftfullt verktyg för att inducera DNA-skador och övervaka rekryteringen av reparation proteiner. Induktion av DNA-skador av laser mikro-bestrålning kan förekomma med olika våglängder, och användare kan tillförlitligt framkalla enda strand raster, bas lesioner och dubbel strand raster med en rad doser. Här, laser mikro-bestrålning används för att undersöka reparation av singel och dubbel strand raster induceras av två gemensamma confocal laser våglängder, 355 nm och 405 nm. Ytterligare, korrekt karakterisering av tillämpad laser dosen för att inducera specifik skada blandningar beskrivs, så att användare kan reproducibly utföra laser mikro-bestrålning datainsamling och analys.

Introduction

Fluorescerande mikroskopi har vuxit fram som en kraftfull teknik för att visualisera cellulära arkitektur, undersöka protein lokalisering och övervaka protein-protein och protein-DNA interaktioner. Med hjälp av fluorescerande mikroskopi för att studera DNA skador Svaren efter tillämpningen av globala DNA skadliga ämnen, såsom ultraviolett (UV) ljus, har joniserande strålning, kemiska oxiderande eller alkylerande medel eller kemoterapeutika gett nya insikter den inledande, signalering och rekrytering av DNA reparation proteiner till platser i DNA skador1,2. Dock dessa globala och asynkron skadliga händelser är begränsande, om detaljerade information om rekrytering ordning, kinetik association eller dissociation och relationerna mellan viktiga proteiner för DNA-reparation söks. Lyckligtvis, framsteg inom laserscanning confocal Mikroskop, bredare tillgång till skada-inducerande laser våglängder, förbättringar i fluorescerande proteiner de senaste 25 åren har gett forskare med förbättrade verktyg för att undersöka dessa aspekter av DNA reparation, genom riktade DNA skador induktion.

Bestrålning av celler med laser microbeams för att studera cellulär och subcellulär funktioner är ett väletablerat verktyg i cellen och strålning biologi3. Tillämpningen av denna teknik för studier av DNA-reparation uppstod när Cremer och medarbetare använde en mycket fokuserad UV (257 nm) laser microbeam system att inducera DNA-skador över en 0.5 µm-plats från kinesisk hamster (CHO) celler4 och etablerade induktion av DNA photolesions av detta system5. Medan erbjuder betydande förbättringar över UV microbeam metoder vid tidpunkten, antagandet av detta plomberingen var begränsad på grund av dess specialiserade Ställ och dess oförmåga att generera bryter double strand (DSBs)6. Efterföljande utredning av en mängd UV-B (290-320 nm) och UV-en (320-400 nm) våglängder av ett antal grupper avslöjade att UV ljusprodukter, oxidativ basera lesioner, enda strand breaks (SSBs) och DSBs kunde förmås beroende på laser våglängd och Power tillämpas4,7,8,9,10 (över 3). Ytterligare, kombinationer av dessa UV-B och UV-A våglängder med sensibiliserande ombud, som psoralen, Bromdeoxiuridin (BrdU) och Hoechst färgämnen, hittades också inducera DNA-skador beroende på våglängd, kraften och varaktigheten av exponeringen, men kraften behövs till framkalla skada sänks ofta i närvaro av dessa agenter11,12,13,14,15. Dessa framsteg utökad användning av mikro-bestrålning, även om det fanns fortfarande tekniska hinder behandlas för bredare antagandet av dessa metoder.

Cremer och medarbetare betydligt avancerade fältet av mikro-bestrålning av just fokusera de UV-microbeam för att applicera betydande skadliga energi över ett starkt lokaliserad område i cellen. Som confocal Mikroskop och lasersystem lokalt avancerad, var tätt fokuserat ljus mer allmänt tillgänglig; koppling UV-källor till omfattningar och behandlar de kromatisk aberration de inducerade fortfarande lämnas dock betydande utmaningar för de flesta användare3,6,16. Som UV färgämnen ökat i popularitet under 1990-talet, optik kan fokusera och fånga UV-upphetsad fluorescens blev mer allmänt tillgängliga16, och förbättringar i laserscanning erbjöd användare fokuserad möjligheten att skapa mycket UV magnetiseringen ställen inom celler6,17. Men det var inte förrän början av 2000 talet att den sanna effekten av denna kombination av hårt fokuserad balkar med högre intensitet laser ansåg, när talrika rapporter framkom visar att DNA strand raster kan induceras med och utan sensibiliserande i den UV-A-området6,10,18,19,20, 405 nm21,22,23,24, 25,26, och även vid längre synliga våglängder som 488 nm27. Dessa framsteg möjliggjorde mer utbrett införande av mikro-bestrålning teknik på ett antal kommersiella system. Parallellt med denna utveckling har framkommit två-photon tekniker också som tillät exakt induktion av DNA-skador; även om dessa framsteg inte kommer att diskuteras här, finns det ett antal översiktsartiklar som diskuterar dessa metoder9,28,29,30.

Med den nuvarande tillgängligheten av confocal Mikroskop kan leverera mycket fokuserad UV-ljus och breda tillgängligheten av fluorescerande proteiner att tillåta realtidsspårning av DNA reparation proteiner, har mikro-bestrålning tekniker utvecklats till kraftfulla verktyg för att undersöka DNA skada svar och reparera vägar. Emellertid, förbrukaren behov till vara medveten om att generationen av DNA-skador är starkt beroende av laser våglängd och makt tillämpas på regionen sub kärnkraft. Användning av UV-C (~ 260 nm) våglängder tillåta direkta DNA excitation och hög selektivitet för induktion av UV ljusprodukter7,8. UV-B och UV-A våglängder producera blandningar av DNA-skador (bas lesion, SSBs och DSBs), beroende på tillämpad kraft och cellulära bakgrunden utnyttjas7. Endogena photosensitizers och antioxidant nivåer i riktade celler kan påverka DNA skador blandningarna produceras av dessa våglängder. Användning av EXOGEN photosensitizers (BrdU, etc.) kan dessutom hjälpa sänka den energi som krävs för induktion av DNA-skador. Men dessa agenter kan inducera DNA-skador av sig själva, och de kan förändra cellcykeln och kromatinstruktur, så deras användning kan ge oönskade effekter som måste beaktas av användaren. Innan du använder mikro-bestrålning för att studera DNA skador respons och reparation, krävs därför noggrant övervägande av DNA-reparation vägen av intresse, våglängderna som är tillgängliga för användning och DNA skada blandningen skapade.

Här, laser mikro-bestrålning utförs på två vanliga våglängder, 355 nm och 405 nm, utan Sensibilisatorer att demonstrera blandningarna av DNA-skador som orsakas av dessa våglängder och de påverkan som dessa skador blandningar har att undersöka reparation avSSBs och DSBs. användare bör vara medveten om att dessa våglängder inte skapar en enda art av strand raster eller bas lesioner. För att diskriminera mellan DNA reparation vägar, måste användare noggrant styra tillämpad makt över en specifik region av kärnan och karakterisera den inducerad skada med flera strand brytmarkörer och DNA lesion antikroppar. Om korrekt tillämpas och kännetecknas, kan laser mikro-bestrålning berika vissa arter av DNA-skador, tillåt förbrukaren till bedöma reparation av bas lesioner och SSBs eller DSBs, med vissa särdrag. Därför har vi skapat en metod som tillåter användare att reproducibly laser mikro-bestrålning, karakterisera DNA skador blandningarna induceras av tillämpad laser dosen, och utföra dataanalys.

Protocol

1. cellkultur och generering av stabil celler

  1. växa CHO-K1 celler i väsentliga minimalmedium kompletteras med 10% fetalt bovint serum. Upprätthålla celler i en fuktad inkubator med 5% CO 2 vid 37 ° C.
  2. Transfect CHO-K1 celler med 1 µg av plasmid DNA som innehåller mänskliga XRCC1 med en C-terminal grönt fluorescerande protein (GFP) taggen med hjälp av en kommersiell transfection reagens efter tillverkaren ' anvisningar.
  3. Välj CHO-K1 celler stabilt uttrycker de mänskliga XRCC1-GFP fusion använder 800 µg/mL geneticin och berika XRCC1-GFP uttrycker befolkningen som använder fluorescens assisterad cell sortering (FACS).
  4. Platta celler vara mikro-bestrålade i odlingskärl med täckglas bottnar, så att de når ungefär 75% eller större konfluens följande dag. Vissa utrymmen mellan celler är önskvärd, särskilt om du använder registrering för att återvända till samma bildfältet (beskrivs i avsnitt 3.2).

2. Mikroskopet set-up

  1. Välj en laserskanning confocal Mikroskop utrustat med lämplig laser och optik och styrprogram för mikro-bestrålning/photostimulation. Presenterade experiment använder en laser skanning confocal Mikroskop som har ändrats för att inkludera en 355 nm laser, fiber-kopplat till en galvanometer ljusaktivering miniscanner och styras via tillverkaren ' s kontroll och analys programvara. Detta system kan utföra mikro-bestrålning i en användare-utsedd region av intresse (ROI) med hjälp av ljusaktivering miniscanner (355 nm laser) eller standard confocal galvanometer (405 nm laser).
  2. Välj våglängden som ska användas för mikro-bestrålning, att säkerställa att alla optiska komponenter i den mikro-bestrålning lightpath är lämpliga för den valda våglängden.
    Obs: Presenterade systemet använder en 40 × C-Apochromat (numeriska bländaröppningen (NA) 1.2) oljeimmersionsobjektivet tillsammans med en UV filter kub för 355 nm mikro-bestrålning och en 20 × C-Apochromat (NA 0,75) torr mål med hjälp av standard confocal lightpath för 405 nm mikro-bestrålning. Syftet för 20 × som används i konfigurationen är inte kompatibel med 355 nm våglängd; Därför använde vi den 40 × för 355 nm endast. Med målsättningen torr för skada kan immunofluorescens protokoll tillämpas nedströms utan rengöring av nedsänkning olja, vilket är varför vi utnyttja detta mål när det är möjligt.
  3. Konfigurera mikroskopet för mikro-bestrålning experimentet. För att behålla överensstämmelsen mellan experiment, utse en standardiserad konfiguration av mikroskopet komponenter som ska användas för varje typ av mikro-bestrålning. Spara inställningarna som en förinställning mikroskopet ' s operativsystem, om möjligt.
    Obs: I systemet presenteras celler är mikro-bestrålade och avbildas med enkelriktad skanning, en skanningsupplösning på 1024 x 1024 pixlar med 1 x scan zoom, vid en bildhastighet 8 bildrutor per sekund (fps), och med pinhole ange ungefärligt 4 luftiga enheter (AU), som bestäms för 488 nm laser (69 µm). Inställningen öppna pinhole valdes för att maximera mängden ljus som fångas i varje bild, medger användning av lägre imaging laser befogenheter och minska fotoblekning.

3. Laser mikro-bestrålning

  1. plats det beredda kultur maträtt, som innehåller celler av intresse, på Mikroskop scenen och snäpper ordentligt.
    1. Om tillgängligt, placera kamrar bild i en scen-top inkubator och upprätthålla vid 37 ° C med 5% CO 2 under skada induktion. Detta steg är viktigast för live-cell timelapse imaging eller imaging långa sessioner. Annars plats celler på mikroskopet arrangerar och utför bestrålning vid rumstemperatur (~ 25 ˚C), och sedan snabbt återvända celler till en inkubator vid 37 ° C med 5% CO 2.
  2. Registrera bildfält att forskaren återvända till samma plats efter utför fixering, färgning eller andra förfaranden. Utföra registrering av skadade fält med hjälp av en kodad, automatiserad Mikroskop scenen eller cell kultur täckglas fartyg med en etsad eller märkt rutnät av XY platser.
    1. Om använder programvara bildregistrering, Välj en igenkännlig funktionen kultur fartygets (dvs, hörnet av täckglas eller barriär mellan brunnar), samla in en bild och registrera platsen för XY. Detta kommer att möjliggöra justering och registrering av XY platser markerade fält efter provberedning.
    2. Om du använder manuell registrering, registrera rutnät eller etsade platser för varje fält manuellt, var noga med att registrera orientering och placering av skålen på scenen.
    3. Om inga identifieringsfunktioner för cell kultur fartygen finns, identifiera skadade fält genom okulärbesiktning av cellmorfologi och densitet. Var noga med för att välja fält med tillräckligt distinkta funktioner vara igenkännligt under senare imaging.
      Obs: Detta kan vara tidskrävande att utföra om inte orientering och området kultur fartygets tätt.
  3. Välj ett fält för mikro-bestrålning och fokusera exemplet. För celler uttrycker fluorescently märkta proteiner, Välj fokalplanet med maximal nukleära tvärsnitt i fluorescerande kanalen av intresse. För celler inte uttrycker märkt proteiner, eller för dem utan tydlig cellkärnelokalisering, faskontrast eller differentiell störningar kontrast (DIC) imaging kan användas att hitta rätt fokalplanet.
    ​ Obs: en praktisk funktion i faskontrast och DIC imaging är det faktum att fokalplanet flyttar genom provet, samma funktion kan visas när ljus eller mörk beroende på det relativa fokalplanet.
    1. Välj en tydlig funktion inom kärnan, såsom en nucleolus, och flytta fokalplanet upp och ner medan du observerar denna förändring i utseende. Sanna fokalplanet kommer att ligga inom övergången från ljus till mörk. För att fokusera exemplet, Välj fokalplanet där funktionen markerade har den skarpaste kontrasten.
  4. Registrera placeringen av fältet av intresse. Skapa en 3 x 3 pixlar kvadrat ROI inom Mikroskop mjukvaran, placera denna ROI över kärnan i en cell skadas och ange detta ROI vara skadan ROI.
  5. Samla en före skada bild, inklusive placeringen av skadan ROI.
    1. För experiment som inte använder fluorescerande proteiner, förvärva en faskontrast eller differential störningar kontrast (DIC) brightfield bild att identifiera och registrera kärnor för skador.
    2. För live-cell experiment med hjälp av fluorescerande proteiner, förvärva en bild som innehåller brightfield och kanalen fluorescens för proteinet av intresse (dvs. laser linje 488 nm för excitation av GFP, laser linje 561 nm för excitation av RFP). I experiment med hjälp av CHO-K1 XRCC1-GFP, fluorescens upphetsad av 488 nm laserlinjen samlades samtidigt med kanalen brightfield överförda DIC.
  6. Initiera laser skador.
    1. i systemet presenteras kontroll laser dosen av den totala tiden tillbringade skanning skadan ROI. Eftersom galvanometer för 355 nm laser fungerar på en fast samplingshastighet, laser dosen styrs av den tid som tillbringas vid upprepade tillfällen scanning valda skadan ROI: i data presenteras här, mikro-bestrålning på 355 nm utförs i 2 och 10 sekunder.
    2. Däremot styr 405 nm laser dosen genom att modulera sökhastighet och utföra en genomsökning av den valda skadan ROI. I data pharmades här, använda 8 och 0,5 fps för mikro-bestrålning vid 405 nm. En avsökningshastighet av 8 fps ger en lägre laser dos än 0,5 fps, eftersom lasern spenderar mindre tid på varje pixel under genomsökningen. Båda lasrar drivs på 100% effekt. Se avsnitt 3.7 instruktioner på att mäta lasereffekt direkt.
      Obs: Varje enskild Mikroskop system kan skilja sig i hur laser power levereras till en utsedda ROI, liknar hur 355 nm och 405 nm skiljer sig i systemet presenteras. Användare kommer att behöva fastställa proceduren för deras Mikroskop system och rapportera dessa parametrar inom deras metoder sektioner.
    3. För levande cell imaging, utföra timelapse bild förvärv av brightfield och fluorescens kanaler. Justera varaktighet och frekvens av timelapse att optimera datainsamling, helst fånga ansamling av fluorescerande proteinet på skadan ROI och dess dissociation över tidsförloppet för experimentet. Experiment med XRCC1-GFP samlat bilder varje 30 sekunder i 20 minuter.
      ​ Obs: frekvensen av timelapse bildtagning kan begränsas av fotoblekning av fluorophore, komplicerande analys av ackumulering och dissociation. Fotoblekning kan utvärderas genom att observera oskadade celler under timelapse och justera förvärv villkor att minimera fluorescerande signalförlust i dessa oskadade celler. Vissa fotoblekning kan vara oundvikliga, så användare kan kompensera för signalförlust genom att normalisera de fluorescerande stödnivåerna skadade celler med oskadade celler i varje bildruta i en timelapse.
      1. Efter tid kursen är klar, Välj ett nytt fält av celler för skador eller åtgärda skadade celler för vidare analys, som beskrivs i avsnitt 4.
      2. Fortsätt mikro-bestrålning och timelapse imaging tills önskat antal skadade celler nås.
        ​ Obs: Vi rekommenderar skadar sammanlagt 10-25 celler per valda villkoret för att bedöma cell till cell heterogenitet som svar på de inducerade skador. Även om de flesta confocal system vilja tillåta förbrukaren till skada mer än en cell under varje mikro-bestrålningen, introducerar detta vacklade skada inledande gånger, vilket kan komplicera analysen av peak rekrytering tid över ett stort antal celler eller dissociation tid för snabba händelser. I vissa system, kan samtidiga skador induktion över flera ROIs minska laser dosen tas emot av varje oberoende ROI. Därför, om inte dessa timing/effekt-frågor behandlas direkt av användaren, rekommenderas det att cellerna skadas individuellt.
    4. För analys av immunofluorescens (om), utföra skador och antingen åtgärda omedelbart celler, som beskrivs i avsnitt 4, eller tillåta celler för att reparera för valda steg om tid (dvs. 1, 5, 10 eller 20 min). Efter önskad tid förflyter, fixa och färga cellerna, som beskrivs i avsnitt 4.
      1. Att öka totala antalet celler för om analys, skada ytterligare fält inom kultur fartyget att generera en flera fält tidsförloppet för svaret efter skada. Spela in XY platsen för varje fält och den tidpunkt då skadan uppstod. Efter den önska totalen reparera tid förflyter, fixa och färga cellerna som beskrivs nedan.
  7. Efter observation av protein rekrytering vid valda doser, åtgärd och rapport laser power nivåer efter fiber och efter målet att noggrant karakterisera och rapportera laser doser. Vi använder en kompakt digital kraftmätare och två olika fotodioden sensor huvuden; en kopplad direkt till laser fiber att mäta efter fiber utgång, och den andra placeras på Mikroskop scenen för att mäta post-objective utdata.
    1. Att mäta lasereffekt, Placera sensorn i önskad konfiguration (efter fiber eller post-objective) och utföra mikro-bestrålning som beskrivs ovan, under de mätningar som görs av wattmetern. Vara medveten om att samplingsfrekvensen för på wattmetern inte kanske är tillräckligt snabb för att fånga mycket snabb mikro-bestrålning evenemang, så det kan vara nödvändigt att köra flera iterationer av experimentet att säkerställa att wattmetern korrekt detekterar den applicerade dosen.
      Obs: För 355 nm laser, Vi mätte en genomsnittlig maximal effekt av ca 5 mW efter fiber och cirka 19 µW efter mål. 405 nm laser, mikro-bestrålning utfördes i slingor av 30 iterationer för att övervinna 0,01 s maximal samplingsfrekvens för wattmetern och genomsnittliga peak befogenheter 1,5 mW och 2.4 mW mättes med scan hastigheter på 8 och 0,5 bildrutor per sekund , respektive. Varje wattmeterns är olika. Användare kommer att behöva fastställa operativa våglängder och samplingsfrekvenser för deras individuella kraftmätare.

4. Immunofluorescens färgning förfaranden

  1. analysera strand paus induktion av om färgning.
    1. Fix celler med 3,7% formaldehyd (försiktighet) fosfat buffrad saltlösning (PBS) för 10 min. Aspirera formaldehydlösning och tvätta 3 gånger med PBS. Protokollet kan stoppas här genom att placera PBS tillbaka på cellerna, och cellerna kan förvaras vid 4 ° c i upp till 1 vecka.
      FÖRSIKTIGHET: Formaldehyd är giftigt och cancerframkallande. Använd lämplig personlig skyddsutrustning och kassera det giftiga ämnet enligt instruktioner från institutionella miljö arbetsmiljöförfaranden.
    2. Permeabilize celler med 0,25% Triton x-100 i PBS under 10 minuter vid rumstemperatur (RT) och sedan tvätta 3 gånger med PBS.
    3. Blockera icke-specifik antikropp bindande genom ruvning i 30 min i PBS med 1% bovint serumalbumin (BSA) på RT.
    4. Inkubera med primära monoclonal antibody mot γH2AX och primära polyklonala antikroppar mot 53BP-1 både utspädning 1: 750 i PBS med 1% BSA för 1 h på RT och tvätta sedan 3 gånger med PBS.
    5. Inkubera cellerna med Alexa 488 get antimus och Alexa 546 get anti-kanin både utspädning 1: 2000 i PBS med 1% BSA för 1 h på RT och tvätta sedan 3 gånger med PBS.
    6. Stain nuclear DNA med en 10 mg/mL lösning av DAPI (4 ', 6-diamidin-2-fenylindol, försiktighet) utspätt till 1: 5000 i PBS för 5 min, eller använda jämförbara nukleära färgämne, och sedan tvätta 3 gånger med PBS.
      Varning: DAPI är giftiga och mutagena. Använd lämplig personlig skyddsutrustning och kasta det giftiga ämnet enligt uppdrag av institutionella miljö arbetsmiljöförfaranden.
    7. Plats PBS eller PBS + 0,1% natriumazid (försiktighet) tillbaka till de färgade cellerna. Protokollet kan stoppas här och celler lagras vid 4 ° c i flera dagar, eller gå vidare till bild förvärvandet i avsnitt 5.
      ​ Försiktighet: Natriumazid är giftiga. Använd lämplig personlig skyddsutrustning och kasta de giftiga ämnena enligt uppdrag av institutionella miljö arbetsmiljöförfaranden.
  2. Analysera induktion av bas lesioner eller DNA addukter av om färgning.
    1. Fix och permeabilize celler i iskall metanol (försiktighet) för 20 min vid -20 ° C.
      Varning: Metanol är giftiga och brandfarliga. Använd lämplig personlig skyddsutrustning och kasta det giftiga ämnet enligt uppdrag av institutionella miljö arbetsmiljöförfaranden.
    2. Aspirera på migthanol och låta provet torka helt i 15 min. protokoll kan stoppas här och celler lagras vid-20 ° c torr i upp till 3 dagar.
    3. Rehydrera cellerna i PBS för 15 min.
    4. Denature DNA med 2 N HCl (försiktighet) för 45 min på RT och tvätta 3 gånger med PBS.
      FÖRSIKTIGHET: HCl är frätande. Använd lämplig personlig skyddsutrustning och kasta det frätande ämnet enligt uppdrag av institutionella miljö arbetsmiljöförfaranden.
    5. Neutralisera i 50 mM Tris-HCl pH 8,8 för 5 min följt av 3 tvättar med PBS.
    6. Inkubera cellerna i blockerande buffert gjort med 5% normala get serum och 0,1% Triton x-100 i PBS för 1 h på RT.
    7. Inkubera med primära antikroppar för 8-oxo-2´-deoxyguanosine (8-oxodG, 1: 400) eller cyclobutane pyrimidin dimer (CPD, 1:1, 000) i get serum blockerande buffert för 1 h på RT och sedan tvätta 3 gånger med PBS.
    8. Inkubera cellerna med Alexa 488 get antimus i förhållandet 1: 2000 i get serum blockerande buffert för 1 h på RT och tvätta 3 gånger med PBS.
    9. Stain nuclear DNA använder 1: 5000 DAPI (10 mg/mL) i PBS för 5 min och tvätta 3 gånger med PBS.
    10. Om använder kamrar täckglas, placera PBS eller PBS + 0,1% natriumazid tillbaka på de färgade cellerna. Protokollet kan stoppas här och celler lagras vid 4 ° c i flera dagar, eller gå vidare till bild förvärvandet i avsnitt 5.
    11. Montera alternativt celler i rekommenderad monteringsmedium, om en ytterligare täckglas kan placeras ovanpå kultur fartyget. En gång botade, monterade celler kan förvaras vid 4 ° c för långa tidsperioder.

5. Bild förvärv för immunofluorescens experiment

  1. rengör botten täckglas av kultur fartyget med etanol och placera den tillbaka på confocal Mikroskop scenen. Säkerställa att orientering och position fartyg på scenen motsvarar orientering och position registreras när skada förmåddes. Säkra kultur fartyget för att säkerställa optimal registrering och imaging.
  2. Hitta tidigare avbildade fält med hjälp av registrering teknik valts (beskrivs i 3.2).
    1. För manuell registrering med ett täckglas med ett etsat rutnät, föra rutnätet i fokus och hitta identifiera märken. Sedan använda inspelade XY-koordinater att hitta skadade celler.
    2. För image-baserad automatiserad registrering, leta upp funktionen strukturella används som referens i steg 3.2.1 och sedan justera den aktuella levande mikroskop vyn så nära att den inspelade bilden som möjligt. När justerade, mäta den nuvarande XY Mikroskop scen läge och jämföra det med XY läge referensbilden. Det linjära avståndet mellan de två platserna definierar de X- och Y-förskjutningen. Gäller denna förskjutning för varje inspelade XY läge att identifiera bilden eller de fält som innehåller bestrålade cellen. Offset funktionen kan vara automatiserad i Mikroskop kontroll mjukvaran eller utförs manuellt.
    3. Om inga lämpliga anmälningscentral kunde identifieras, manuellt leta upp celler genom att skanna bilden och att hitta funktionerna som tidigare identifierade cell.
  3. Hämta bilder med lämpliga Mikroskop inställningar för att samla alla färgade mål, inklusive en brightfield bild (inställning i avsnitt 2.3 och fokus i avsnitt 3.3). I presenteras experiment, flerkanaliga bilder samlades in med hjälp av följande excitation laserlinjerna och fluorophores: 405 nm (DAPI), 488 nm (Alexa 488 och överförda DIC brightfield) och 561 nm (Alexa 546). Alla lasrar passera genom ett enda acousto-optisk avstämbara filter styr överföringen av både laser våglängd och makt.

6. Levande cellen bildanalys av rekrytering av fluorescerande proteiner till mikro-bestrålade webbplatser

  1. Öppna förvärvade bilder i ansökan bild analys (NIS element eller ImageJ). Om nödvändigt, kombinera före bestrålning bilden med timelapse bilder att generera en enda bildsekvens av före och efter skadan induktion. Användare kan visa rekrytering genom att mäta förändringar i fluorescerande intensitet över det bestrålade området i förhållande till fluorescensintensiteten mätt över hela kärnan (se representativa resultat figur 1 B. ).
  2. För varje cell som ska mätas, först skapa en referens ROI som representerar kärnan. Använder en algoritm för tröskelvärde på fluorescerande signalen som innehåller bildpunkter som utgör kärnan och sedan omvandla detta område till en ROI. Vid behov kan ROI dras manuellt i med brightfield som referens. Justera ROI över tid kursen att säkerställa det nukleära området bevakas noggrant av ROI och rapportera genomsnittlig fluorescensintensiteten hos fluorescerande signalen inom denna ROI för varje bildruta.
  3. För varje cell mätas skapar en 6 x 6-pixel ROI och placera den över skador ROI för varje bildruta i tidsförloppet. Denna större ROI är nu skadan ROI för analys. Rapport menar ROI fluorescensintensiteten för varje bildruta.
    Obs: De flesta kommersiella bild analys programvara innehåller moduler för 2D objektföljning, och det finns ett antal Användarutvecklade makron för ImageJ eller FIJI som underlättar snabbare arbetsflöde och högre genomströmning (se https://imagej.nih.gov/ij/plugins/).
  4. Normalisera betyder skada ROI fluorescensintensiteten som för en motsvarande referens ROI i varje bildruta i en timelapse. Här menar nukleära fluorescensintensiteten används som referens ROI (se representativa resultat figur 1). normalisering kan utföras genom att subtrahera den genomsnittliga referensen ROI fluorescensintensiteten från medelvärdet skada ROI fluorescensintensiteten eller genom att dividera medelvärdet skada ROI fluorescensintensitet med den genomsnittliga hänvisningen ROI fluorescensintensiteten.
    Obs: Normalisering av division kan ge oförutsägbara resultat, om de används i situationer med mycket låg intensitet referensvärden.
  5. Upprepa för alla skadade celler, liksom för minst två kontroll, oskadade celler. Kontrollresultat cell kan användas för ytterligare normalisering, om så krävs.
  6. Grafen normaliseras intensitetsvärden över tiden att visa ändringar i rekrytering dynamics som en funktion av experimentell behandling.

7. Bildanalys av protein rekrytering påvisas med immunofluorescens

  1. öppen före och efter skadan bilder i ansökan bild analys. Före skadan bilderna innehåller skadan ROI(s) används för mikro-bestrålning. Kopiera ROI(s) och klistra in de efter skada bilderna att identifiera riktade celler.
  2. Generera en 6 x 6 pixel ROI för analys av protein rekrytering och placera detta ROI på platsen för skadan ROI. Denna större ROI är nu skadan ROI för analys. Rapportera den genomsnittliga skadan ROI fluorescensintensiteten.
  3. Normalisera betyder skada ROI fluorescensintensiteten som för en motsvarande referens ROI. Här menar nukleära fluorescensintensiteten hos den skadada cellen används som referens ROI (se representativa resultat figur 1). Generera hänvisningen ROI med hjälp av en algoritm för tröskelvärde på DAPI signalen för att definiera kärnan, och sedan konvertera detta område till en ROI. Rapportera den genomsnittliga referensen ROI fluorescensintensiteten. Normalisering kan utföras genom att subtrahera genomsnittlig referensen ROI fluorescensintensiteten från genomsnittliga skadan ROI fluorescensintensiteten, eller genom att dividera medelvärdet skadan ROI fluorescensintensiteten av genomsnittlig hänvisningen ROI fluorescensintensiteten.
    Obs: Normalisering av division kan ge oförutsägbara resultat, om de används i situationer med mycket låg intensitet referensvärden.
  4. Upprepa för alla skadade celler och utföra samma analys på minst två kontroll celler, enligt ovan.
  5. Grafen normaliseras intensitetsvärdena för varje uppmätt mikro-bestrålning händelse mot tiden för att visa ändringar i protein rekrytering eller typ av DNA-skador som en funktion av experimentell behandling.

Representative Results

Karakterisering av inducerad DNA-skador
Induktion av bas lesioner och strand raster är beroende av laser dosen tillämpas på valda nukleära området och den cellulära mikromiljö av cell modell används7. Fluorescerande proteiner smält att reparera protein, såsom XRCC1, 53BP1, Ku70 eller Rad51, ge användbar single och double strand brytmarkörer för att fastställa den minimal energi som krävs för att se ansamling av en fluorescerande protein inom en skada ROI ovan den bakgrunden fluorescens9,19,31. När villkor som inducerar ett svar hittas, är det kritiskt att karakterisera skador blandningen framkallas av att viss våglängd och dos. Dämpning av dos och längd vid den våglängd som används kan tillåta användaren att minimera bildandet av komplex skada blandningar. Låga laser doser inom intervallet UV-A har påvisats för att producera huvudsakligen SSBs och en liten mängd bas lesioner, lämpliga för att studera SSBR och BER vägar10,28. Öka dosen skapar mer komplexa bas lesioner, oxidativ och UV-inducerad, och inducerar mer betydande antal DSBs7,10. Även induktion av en enda art av DNA-skador är önskvärt för undersökning av specifika DNA reparation vägar, är det mer sannolikt att användarna förmå en blandning av DNA lesioner, med en specifik lesion som SSBs att vara mycket mer frekvent än bas lesioner eller DSBs. Detta liknar DNA skador blandningar inducerats av kemiska agenser som väteperoxid (H2O2) eller metyl methanesulfonate (MMS)32. Förbrukaren behov till vara medveten när de rapporterar resultat som skada blandningar kan uppstå, och noggrann karakterisering av dosen och lesioner på webbplatsen inducerad skada är nödvändigt att säkerställa reproducerbarhet och jämförbarhet av deras resultat.

I micro-bestrålning studier används XRCC1-GFP ofta som markör för induktion av bas lesioner och SSBs9,28. XRCC1 är en byggnadsställning-protein som spelar en viktig roll i SSB reparation (SSBR) och bas excision reparation (BER), och deltar också i andra reparation vägar, som nucleotide excision repair (NER)33,34,35 . Den spelar en viktig samordnande roll i DNA-reparation, interagera med ett antal viktiga proteiner, inklusive poly(ADP-ribose) polymeras 1 (PARP-1), DNA-polymeras β (Pol β), och DNA-ligase III. Vi utnyttjade XRCC1-GFP stabilt uttryckt i CHO-K1 celler för att avgöra de laser-doser som krävs för att generera SSBs och DSBs. Vi först identifierade den minsta dos som krävs för att framkalla en observerbar rekrytering av XRCC1-GFP för varje våglängd (figur 1). För 355 nm våglängd, en 2 s dröjtiden över definierade skadan genererade ROI en ökad fluorescerande signal inom att ROI, som anger induktion av DNA-skador som var detekterbar över bakgrunden (figur 1A). För 405 nm, en 8 fps sökhastighet behövdes för att generera en observerbar rekrytering till skadan ROI (figur 1A). Dosen ökades sedan (10 s för 355 nm och 0,5 fps för 405 nm) att skapa en mer intensiv skada ROI (figur 1A).

Rekrytering och bibehållande av XRCC1-GFP på platsen för inducerad skada var då övervakas av timelapse imaging. Retention av proteinet vid platsen för DNA-skador kan indikera pågående DNA-reparation, medan dissociation av proteinet från platsen för inducerad skada anses ofta vara en markör för slutförande av BER eller SSBR. Det har dock inga tydliga bevis för sambandet mellan dissociationen av XRCC1 från laser-inducerad DNA skada platser med slutförandet av reparation. Rekrytering av proteinet till platsen för skadan mäts genom att rapportera genomsnittliga intensiteten av fluorescerande signalen inom skadade ROI över genomsnittlig fluorescerande signalen mäts för hela kärnan (figur 1B). Denna typ av normalisering hjälper adress intensitet fluktuationer i kärn-signalen, men andra normalisering tekniker kan användas beroende på cellulära fördelningen av proteinet av intresse. Här, är XRCC1 lokaliserad i den nukleära kupén, så normalisering till området nukleära åtgärder omfördelning av signalen till skadan ROI. ROI genomsnittlig fluorescerande intensiteten sedan spelas in för varje bild i den timelapse, inklusive före skada bilden, och ett diagram som funktion av tiden (figur 1C).

Vi kännetecknas sedan ytterligare skador orsakade av de två valda laser doserna att undersöka bildandet av DNA bas lesioner. Först, var bildandet av CPD, en skrymmande UV-inducerad lesion, trotsat av immunofluorescens som markör för NER typ lesioner (figur 2A). Sedan var den oxidativt inducerad bas lesion8-oxodG utforskad som markör för BER typ lesioner (figur 2B). Ingen signifikant ökning CPD lesioner observerades vid låg dos exponering för både våglängder (2 s för 355 nm och 8 fps för 405 nm), medan höga dos behandling vid båda våglängder (10 s för 355 nm och 0,5 fps för 405 nm) visade en signifikant ökning i lysrör signal som observerats inom skadan ROI (figur 2A). Ett spridningsdiagram av CPD ROI menar intensitet för varje skadad cell visar heterogenitet i skadan bildandet och upptäckt både våglängder och doser, som anger att en låg nivå av CPD lesioner kan förekomma vid lägre doser, men belastningen inte får avsevärt upptäcks förrän en högre dos appliceras. Spridningsdiagram föreslår också att ineffektivitet i påvisande av antikroppar som kan begränsa exakt kvantifiering av skador blandningar.

Detta understryks ytterligare för detektion av oxidativt inducerad DNA lesioner av den markör 8-oxodG. Ingen tydlig ökning av fluorescerande signalen i skadan ROI observerades för 8-oxodG antingen laser våglängd eller dos används (figur 2B). Antikroppen används för detta arbete är förenligt med tidigare publikationer9,10,36. Det bör dock noteras att det kan finnas begränsningar i att observera bildandet av 8-oxodG med antikroppar37,38. Bekräftelse av bristen av oxidativt inducerad lesioner rekommenderas också av en andra markör, liksom rekrytering av 8-Oxoguanine DNA glykosylas (OGG1), enzymet som ansvarar för avlägsnande av 8-oxodG från DNA10. Vi inte iaktta OGG1 rekrytering till våra DNA skada platser; men bildandet av låga nivåer av oxidativt inducerad DNA-skador kan inte uteslutas helt.

Slutligen undersökte vi bildandet av DSBs använder två markörer, γH2AX och 53BP-1, på den Markera med hjälpd laser doser genom immunofluorescens (figur 3 & 4). ΓH2AX används ofta som en strand bryta markör, men dess specificitet för DSBs har ifrågasatts i ett antal rapporter39,40. Dessutom är det en fosforylering händelse som propagerar från webbplatsen strand paus så lokalisering av signalen till en strand semester kan vara begränsad på grund av detta signalen förökning. Därför möjliggör att kombinera γH2AX med 53BP-1 noggrannare bedömning av DSB formation inom skadan ROI.

Svaret av γH2AX och 53BP-1 mikro-bestrålning är både våglängd och dosberoende. Den låga dosen (2 s) stimulering på 355 nm framkallar inga svar vid 5 och 20 min, och en svag och varierande svar 10 min post bestrålning (figur 3A) för båda markörer. Den höga dosen (10 s) av 355 nm mikro-bestrålning inducerar en ökad fluorescerande signal inom skadan ROI på 5, 10 och 20 min post bestrålning som reduceras vid 40 min (figur 3B). Dessa resultat indikerar att försiktig titrering av 355 nm dosen krävs för att minimera cross-stimulering av reparation gångvägar, vilket framgår av minskad upptäckten av dubbla strand paus markör γH2AX på tidiga punkter (< 20 min) i låg dos tillämpas.

Liknande experiment utfördes med både låg (8 bps) och hög dos (0,5 fps) 405 nm laser stimulering (figur 4). Vid denna våglängd observerades betydande ansamling av fluorescerande intensitet inom skadan ROI för både 53BP-1 och γH2AX oavsett applicerade dosen, vilket indikerar att dessa doser generera en komplex blandning av enkel- och Dubbelrum strand raster nästan omedelbart efter induktion av DNA-skador (figur 4). Dessutom höga doser av 405 nm visar en ökning av pan-nukleära γH2AX färgning inom 10 min skada induktion (figur 4B, botten) som försvårar upptäckten av skadan ROI betänkande, medan 53BP-1 ansamling är mer omfattas skadan ROI.

Dessa resultat visar tydligt att 405 nm mikro-bestrålning är inte lämpliga för övervakning SSBR eller BER, och att flera markörer för DNA addukter och strand raster skall användas till fullt karakterisera inducerade skador och DNA reparation svaren.

Dosberoende förändring i rekrytering och bibehållande av XRCC1-GFP
När den inducerade DNA-skadan har karakteriserats, kan laser mikro-bestrålning vara en idealisk plattform för att studera dynamiken i DNA reparation proteiner. Kvarhållande och dissociation kineticsen av den XRCC1-GFP visar ett dos-beroende (figur 1), vilket inte är oväntad tanke induktion av olika skador blandningar av varje våglängd. De högsta bestrålning doserna (10 s och 0,5 fps) visar en högre intensitet rekrytering av XRCC1-GFP i förhållande till de lägre doserna och längre lagring av de XRCC1-GFP på platsen för skadan under 20 min tid (figur 1C). Detta indikerar att den DNA-skador som skapats vid högre doser för både 355 och 405 nm är sannolikt inte löst under experimentet, vilket är förenligt med utseende och bevarande av DSB markörer, γH2AX och 53BP-1 (figurerna 3 & 4 ).

Intressant, visar de lägre skador doserna (2 s och 8 fps) snabb rekrytering av XRCC1-GFP till skada platser och dissociation av XRCC1-GFP under experimentell tid före bestrålning nivåer (figur 1C). Utan fullständig karakterisering av skador blandningen, kan detta leda till slutsatsen att SSBs och bas lesioner helt kan lösas med hjälp av dessa skadliga villkor. Men, förekomsten av γH2AX och 53BP-1 vid 40 min för 355 nm och 5 min för 405 nm kan leda till olika tolkningar. För 355 nm 2 s dos, skada blandningen kan vara huvudsakligen SSBs, så utseendet på DSB markörer på 40 min kan tyda på att en del oreparerade lesioner kan vara leder till DSBs eller att DSBs som genereras av denna energi är reparerad på en längre tidsskala. Skala tidsskillnader mellan SSBR och DSB reparation har varit tidigare rapporterade28,41,42. Likaså 405 nm låg dos (8 bps) dissociation kan tyda på en låg nivå av SSBs eller ett kluster av SSBs som snabbt omvandlas till DSBs, som har noterats för hög skada mikro-bestrålning och andra DNA skadliga ämnen tidigare43, 44 , 45.

Tillsammans dessa resultat betona vikten av att karakterisera de inducerade skador blandningarna och utnyttja flera DNA reparation proteiner och markörer för tolkningen av rekrytering och kvarhållning av DNA reparerar proteiner på platser av inducerade skador.

Figure 1
Figur 1 . Laser mikro-bestrålning inducerar rekrytering av XRCC1-GFP. 
(A) CHO-K1 celler som stabilt uttrycker XRCC1-GFP var bestrålade och avbildas före och omedelbart efter skadan induktion. Pilar indikerar platsen för mikro-bestrålning dos och skalstapeln är 10 µm. (B) rekrytering mäts genom att bestämma medelvärdet fluorescerande intensiteten inom skadan ROI och normaliserad till genomsnittlig fluorescerande intensiteten av hela kärnan. (C) dynamiken i rekrytering kan mätas för varje timelapse bild. Grafer är representativa för två oberoende experiment med felstaplar representera SEM (n = 24). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Laser mikro-bestrålning inducerar nukleotid skador. 
CHO-K1 celler utsattes för att laser mikro-bestrålning och fast omedelbart efter skada induktion. Immunofluorescens utfördes för att upptäcka CPD och 8-oxodG addukter. (A) toppen, spridningsdiagram den ROI genomsnittlig fluorescensens intensitet hos skadade celler efter CPD färgning. Botten, representativa bilder av CPD färgning. Pilar indikerar platsen för mikro-bestrålning och skalstapeln är 10 µm (n = 12). B representativa bilder för 8-oxodG färgning. PilarAnge platsen för mikro-bestrålning och skalstapeln är 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . DNA double strand brytmarkörer svara på 355 nm mikro-bestrålning på ett dosberoende sätt. 
CHO-K1 celler utsattes för mikro-bestrålning och fast på den tid punkter angivna efter stimuleringen. Immunofluorescens för DSB markörer γH2AX och 53BP-1 utfördes. (A) scatter plot normaliserat skada ROI menar fluorescens stödnivåer mätt för oskadade och skadade celler. Felstaplar är representativa för SEM (n = 12). B representativa bilder för γH2AX och 53BP-1 färgning. Pilar indikerar platsen för mikro-bestrålning och skalstapeln är 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. DNA double strand brytmarkörer reagera kraftfullt på 405 nm mikro-bestrålning.
CHO-K1 celler utsattes för mikro-bestrålning och fast på tid punkter angivna post stimulering. Immunofluorescens för DSB markörer γH2AX och 53BP-1. (A) scatter plot normaliserat skada ROI menar fluorescens stödnivåer mätt för oskadade och skadade celler. Felstaplar är representativa för SEM (n = 12). B representativa bilder för γH2AX och 53BP-1 färgning. Pilar indikerar platsen för mikro-bestrålning och skalstapeln är 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Discussion

Med de villkor som beskrivs här, kan någon confocal Mikroskop med en UV-A eller 405 nm laser, antingen integrerad av tillverkaren eller av slutanvändaren, inducerar DNA-skador inom kärnan i en cell och tillåta rekrytering av DNA reparation proteiner till platsen för inducerad DNA-skador som ska övervakas. Tillämpas dock makt, som noteras i protokollet och representativa resultat, våglängd urval, och skada karakterisering är alla viktiga frågor som måste lösas först av användaren för att studera en viss DNA reparation väg. Dessutom finns det andra överväganden i experimentell design som också måste beaktas av användare.

För att övervaka en proteinets beteende i levande celler inlägg mikro-bestrålning, en fluorescently märkt protein måste skapas. Tillgången till ett brett utbud av fluorescerande proteiner som kan separeras spektralt erbjuder verktyg för att skapa protein fusioner som kan användas för att karaktärisera cellulära svar till induktion av DNA-skador. Övergående transfection av fluorescerande proteiner av intresse möjliggör snabb screening av skadliga villkor, mutationer eller ens hämmare, medan stabilt transfekterade celler erbjuder mer kontroll över uttrycksnivåerna och möjliggör andra biokemiska karakteriseringar som ska utföras, validera mikro-bestrålning resultat. Spektralt distinkta fluorescerande proteiner kan också utnyttjas i samma cell att övervaka interaktioner mellan proteiner inom samma vägen eller i olika vägar. Fluorescerande proteiner också eliminera behovet av specifika antikroppar för varje protein av intresse och tillåta levande cell övervakning av protein beteende under en längre tid efter induktion av skador.

Användning av fluorescerande proteiner har emellertid också nackdelar. Utan genetiska bakgrunder bristfällig i proteinernas sevärdheter, kommer att endogena proteiner konkurrera med fluorescently märkta proteiner. Böjningar av fluorescerande etiketten till den N eller C ändstationen av protein kan ändra proteinveckning, hindrar viktig protein-protein interaktioner eller blockera translokation signaler; att ändra funktion och potentiellt påverkar rekrytering dynamics. Dessa effekter har påvisats i ett antal rapporter där Immunofluorescerande färgning visade dramatiskt annorlunda rekrytering och retentionstiderna för endogena proteiner på skada plats28. Användning av övergående transfection eller stabil kloner kan också förändra observerad, vanligtvis genom variationer i uttrycket proteinnivåer respons. Vidare kan användning av flera fluorescerande proteiner i en enda experiment också ändra dynamiken i rekrytering, om proteinnivåer inte är jämviktas väl eller om rekrytering av större fluorescently-märkta proteinet blockerar rekrytering av andra proteiner . Slutligen, fluorescerande proteiner kan fungera som svag sensibilisering ombud, ökar bildandet av reaktiva syreradikaler, och potentiellt förändra den DNA skador blandningar inducerad46,47. Trots dessa nackdelar erbjuder fluorescerande proteiner ett antal tydliga fördelar i att studera DNA reparation med mikro-bestrålning och om användare införliva lämpliga kontroller, till exempel skador karakterisering beskrivs här, kan de ge nya insikter till skador svar och protein-protein interaktioner3.

Om levande cell imaging inte krävs, kan immunofluorescens användas för att övervaka svaret på inducerade skador. Genom att fastställa celler vid specifika tidpunkter post skada induktion och färgning med antikroppar specifika för proteiner och lesioner av intresse, statiska ögonblicksbilder av skador induktion och rekrytering och bibehållande av reparation proteiner kan byggas. Antikroppar kan användas för att övervaka rekryteringen av flera proteiner av räntesatser och post-translationella modifieringar inducerad av DNA skada svar. Användning av immunofluorescens eliminerar behovet av fluorescerande proteiner, och möjliggör endogen protein beteende som skall undersökas. Men har denna metod också sina nackdelar. Mycket specifika antikroppar är nödvändiga, och permeabilisering och blockerande förfaranden behöver optimeras för att möjliggöra upptäckt av rekrytering med tillräcklig signalintensitet. Fastställande förfaranden är inte omedelbara, och denna fysiska begränsning begränsar den temporal upplösningen av denna strategi. Mappning av platsen för skador induktion så celler kan vara nytt beläget efter färgning kan också medföra betydande utmaningar. Mikroskopet confocal används i detta arbete möjliggör image-baserad registrering enligt ovan, så skadade celler kan omplaceras med hög precision. Om scenen registrering eller etsade täckglas inte är tillgänglig, den tid investeringar inblandade i kan buffertzonen celler utan scenen registrering, tillsammans med den inneboende fördröjningen mellan skadorna induktion och avbildad rekrytering, göra immunofluorescens ointressant att vissa användare. Dock kommer att de mest korrekt och komplett mikro-bestrålning experimentell designerna införliva dessa typer av tillvägagångssätt parallellt med hjälp av fluorescerande proteiner, som beskrivs i protokollet presenteras.

Här används både levande cell imaging och immunofluorescens att påvisa nyttan av laser mikro-bestrålning. Immunofluorescerande färgning tillåter oss att noggrant undersöka blandningen av DNA-skador som skapats och rekrytering av proteiner som induceras av varje lasereffekt, som tillåter oss att bättre tolka de observerade förändringarna i rekrytering och bibehållande av XRCC1-GFP. Baserat på dessa resultat kan användning av 405 nm lasrar begränsas för undersökning av BER och SSBR proteiner. Ytterligare, den optimala experimentell designen skulle omfatta power mätningar efter målet, en full skada blandning karakterisering för varje cellinje som används och validering av rekrytering och retention observerats i fluorescently märkta proteiner med immunofluorescens. Självklart, utrustning, tid och kostnad överväganden kan göra dessa optimala experimentella designer omöjligt för vissa användare. Men betydelsen av dessa beståndsdelar demonstreras här och användare bör ha dessa överväganden i åtanke när du börjar mikro-bestrålning experiment.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Dr Samuel H. Wilson vid nationella institutet för miljö hälsa vetenskaper för de cellinjer som används i detta arbete.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nikon A1rsi laser scanning confocal microscope Nikon
NIS Elements software Nikon
355 nm laser PicoQuant VisUV Radiation source
Galvanometer photoactivation miniscanner Bruker
Microscope slide photodiode power sensor THORLabs S170C
Fiber photodiode power sensor THORLabs S150C
Digital handheld optical power and energy meter THORLabs PM100D
CHO-K1 From Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS
Minimal essential media Hyclone SH3026501
Fetal bovine serum Atlanta biologicals S11550
XRCC1-GFP Origene RG204952
Jetprime Polyplus transfection 11407
Geneticin ThermoFisher 10131035
4 chambered coverglass ThermoFisher 155382
8 chambered coverglass ThermoFisher 155409
Anti 53BP-1 Novus NB100304
Anti-phospho-histone H2AX  Millipore 05-636-I
Anti cyclobutane pyrimidine dimer Cosmo Bio clone CAC-NM-DND-001
Anti 8-oxo-2´-deoxyguanosine  Trevigen 4354-MC-050
Alexa 488 goat anti-mouse ThermoFisher A11029
Alexa 546 goat anti-rabbit ThermoFisher A11010
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) ThermoFisher R37606 Caution toxic!
Phosphate buffered saline ThermoFisher 0780
Normal goat serum ThermoFisher 31873
Bovine serum albumin (BSA) Jackson Immuno Research 001-000-162
37% Formaldehyde ThermoFisher 9311 Caution toxic!
Ethanol Decon Labs 2716
Methanol VWR BDH1135 Caution toxic!
HCl Fisher SA49
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 Caution toxic!
Tris Hydrochloride Amresco O234
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Luijsterburg, M. S., et al. Stochastic and reversible assembly of a multiprotein DNA repair complex ensures accurate target site recognition and efficient repair. J Cell Biol. 189 (3), 445-463 (2010).
  2. Vermeulen, W. Dynamics of mammalian NER proteins. DNA Repair (Amst). 10 (7), 760-771 (2011).
  3. Berns, M. W. A history of laser scissors (microbeams). Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).
  4. Cremer, C., Cremer, T., Zorn, C., Schoeller, L. Effects of laser uv-microirradiation (lambda = 2573 A) on proliferation of Chinese hamster cells. Radiat Res. 66 (1), 106-121 (1976).
  5. Cremer, C., Cremer, T., Fukuda, M., Nakanishi, K. Detection of laser--UV microirradiation-induced DNA photolesions by immunofluorescent staining. Hum Genet. 54 (1), 107-110 (1980).
  6. Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells. J Microsc. 209, (Pt 2) 71-75 (2003).
  7. Kielbassa, C., Roza, L., Epe, B. Wavelength dependence of oxidative DNA damage induced by UV and visible light. Carcinogenesis. 18 (4), 811-816 (1997).
  8. Kielbassa, C., Epe, B. DNA damage induced by ultraviolet and visible light and its wavelength dependence. Methods Enzymol. 319, 436-445 (2000).
  9. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 37 (9), 68 (2009).
  10. Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (38), 13738-13743 (2004).
  11. Krasin, F., Hutchinson, F. Strand breaks and alkali-labile bonds induced by ultraviolet light in DNA with 5-bromouracil in vivo. Biophys J. 24 (3), 657-664 (1978).
  12. Krasin, F., Hutchinson, F. Double-strand breaks from single photochemical events in DNA containing 5-bromouracil. Biophys J. 24 (3), 645-656 (1978).
  13. Rosenstein, B. S., Setlow, R. B., Ahmed, F. E. Use of the dye Hoechst 33258 in a modification of the bromodeoxyuridine photolysis technique for the analysis of DNA repair. Photochem Photobiol. 31 (3), 215-222 (1980).
  14. Cremer, T., Peterson, S. P., Cremer, C., Berns, M. W. Laser microirradiation of Chinese hamster cells at wavelength 365 nm: effects of psoralen and caffeine. Radiat Res. 85 (3), 529-543 (1981).
  15. Limoli, C. L., Ward, J. F. A new method for introducing double-strand breaks into cellular DNA. Radiat Res. 134 (2), 160-169 (1993).
  16. Carlsson, K., Mossberg, K., Helm, P. J., Philip, J. Use of UV excitation in confocal laser scanning fluorescence microscopy. Micron and Microscopica Acta. 23 (4), 413-428 (1992).
  17. Stelzer, E. H. K., Haar, F. -M. Confocal Microscopy: Recent Developments. Advances in Imaging and Electron Physics. 106, 293-345 (1999).
  18. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).
  19. Tashiro, S., Walter, J., Shinohara, A., Kamada, N., Cremer, T. Rad51 accumulation at sites of DNA damage and in postreplicative chromatin. J Cell Biol. 150 (2), 283-291 (2000).
  20. Gassman, N. R., Stefanick, D. F., Kedar, P. S., Horton, J. K., Wilson, S. H. Hyperactivation of PARP triggers nonhomologous end-joining in repair-deficient mouse fibroblasts. PLoS One. 7 (11), 49301 (2012).
  21. Bolin, C., et al. The impact of cyclin-dependent kinase 5 depletion on poly(ADP-ribose) polymerase activity and responses to radiation. Cell Mol Life Sci. 69 (6), 951-962 (2012).
  22. Godon, C., et al. PARP inhibition versus PARP-1 silencing: different outcomes in terms of single-strand break repair and radiation susceptibility. Nucleic Acids Res. 36 (13), 4454-4464 (2008).
  23. Hanssen-Bauer, A., et al. XRCC1 coordinates disparate responses and multiprotein repair complexes depending on the nature and context of the DNA damage. Environ Mol Mutagen. 52 (8), 623-635 (2011).
  24. Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Res. 35 (22), 7665-7675 (2007).
  25. Mortusewicz, O., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. Spatiotemporal dynamics of regulatory protein recruitment at DNA damage sites. J Cell Biochem. 104 (5), 1562-1569 (2008).
  26. Mortusewicz, O., Rothbauer, U., Cardoso, M. C., Leonhardt, H. Differential recruitment of DNA Ligase I and III to DNA repair sites. Nucleic Acids Res. 34 (12), 3523-3532 (2006).
  27. Solarczyk, K. J., Zarębski, M., Dobrucki, J. W. Inducing local DNA damage by visible light to study chromatin repair. DNA Repair (Amst). 11 (12), 996-1002 (2012).
  28. Gassman, N. R., Wilson, S. H. Micro-irradiation tools to visualize base excision repair and single-strand break repair. DNA Repair (Amst). 31, 52-63 (2015).
  29. Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O'Neill, P. Use of near infrared femtosecond lasers as sub-micron radiation microbeam for cell DNA damage and repair studies. Mutat Res. 704 (1-3), 38-44 (2010).
  30. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Front Genet. 4, 135 (2013).
  31. Lan, L., et al. Accumulation of Werner protein at DNA double-strand breaks in human cells. J Cell Sci. 118, Pt 18 4153-4162 (2005).
  32. Salmon, T. B., Evert, B. A., Song, B., Doetsch, P. W. Biological consequences of oxidative stress-induced DNA damage in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 32 (12), 3712-3723 (2004).
  33. Caldecott, K. W. DNA single-strand break repair. Exp Cell Res. 329 (1), 2-8 (2014).
  34. London, R. E. The structural basis of XRCC1-mediated DNA repair. DNA Repair (Amst). 30, 90-103 (2015).
  35. Moser, J., et al. Sealing of chromosomal DNA nicks during nucleotide excision repair requires XRCC1 and DNA ligase III alpha in a cell-cycle-specific manner. Mol Cell. 27 (2), 311-323 (2007).
  36. Campalans, A., et al. Distinct spatiotemporal patterns and PARP dependence of XRCC1 recruitment to single-strand break and base excision repair. Nucleic Acids Res. 41 (5), 3115-3129 (2013).
  37. Cooke, M. S., Lunec, J. Immunochemical detection of oxidative DNA damage. Vol. I. , World Scientific. 275-293 (2003).
  38. Rossner, P., Sram, R. J. Immunochemical detection of oxidatively damaged DNA. Free Radic Res. 46 (4), 492-522 (2012).
  39. Cleaver, J. E., Feeney, L., Revet, I. Phosphorylated H2Ax is not an unambiguous marker for DNA double-strand breaks. Cell Cycle. 10 (19), 3223-3224 (2011).
  40. Rybak, P., et al. Low level phosphorylation of histone H2AX on serine 139 (γH2AX) is not associated with DNA double-strand breaks. Oncotarget. 7 (31), 49574-49587 (2016).
  41. Haince, J. F., et al. PARP1-dependent kinetics of recruitment of MRE11 and NBS1 proteins to multiple DNA damage sites. J Biol Chem. 283 (2), 1197-1208 (2008).
  42. Caldecott, K. W. Single-strand break repair and genetic disease. Nat Rev Genet. 9 (8), 619-631 (2008).
  43. Lomax, M. E., Gulston, M. K., O'Neill, P. Chemical aspects of clustered DNA damage induction by ionising radiation. Radiat Prot Dosimetry. 99 (1-4), 63-68 (2002).
  44. Ma, W., Westmoreland, J. W., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. Alkylation base damage is converted into repairable double-strand breaks and complex intermediates in G2 cells lacking AP endonuclease. PLoS Genet. 7 (4), 1002059 (2011).
  45. Siddiqi, M. A., Bothe, E. Single- and double-strand break formation in DNA irradiated in aqueous solution: dependence on dose and OH radical scavenger concentration. Radiat Res. 112 (3), 449-463 (1987).
  46. Sano, Y., Watanabe, W., Matsunaga, S. Chromophore-assisted laser inactivation--towards a spatiotemporal-functional analysis of proteins, and the ablation of chromatin, organelle and cell function. J Cell Sci. 127, (Pt 8) 1621-1629 (2014).
  47. Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biol. 2, 368-376 (2014).

Tags

Cancerforskning problemet 127 DNA-reparation laser mikro-bestrålning DNA-skador strand paus XRCC1 gamma-H2AX strand paus signalering
Tillämpning av Laser mikro-bestrålning för undersökning av singel och dubbel Strand paus reparation i däggdjursceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Holton, N. W., Andrews, J. F.,… More

Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (127), e56265, doi:10.3791/56265 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter