Personalizzato Peptide matrici per il rilevamento di anticorpi HLA nei trapianti d'organo
Summary
Mancate corrispondenze nelle sequenze (HLA) l’antigene umano del leucocita tra donatore di organi e destinatario coppie sono la principale causa di rigetto anticorpo-mediato nel trapianto dell’organo. Qui presentiamo l’uso di matrici di antigene personalizzati che si basano su sequenze di singoli donatori HLA per sondare gli alloanticorpi di anti-donatori HLA nei destinatari dell’organo.
Abstract
Nei trapianti d’organo, la funzione e la longevità dell’innesto criticamente si basano sul successo del controllo della reattività di rigetto immunologico contro gli antigeni umani del leucocita (HLA). Istocompatibilità linee guida sono basate su prove di laboratorio di immunità anti-HLA, che presenta sia come pre-esistente o de novo generato anticorpi HLA che costituiscono una barriera importante trapianto. Prove correnti sono costruiti su una piattaforma di singolo-antigene Perline (SAB) utilizzando un insieme fisso di ~ 100 antigeni ricombinanti preselezionati per sondare sieri di trapianto. Tuttavia, negli esseri umani esiste una maggiore varietà di tipi di HLA, con nessun due individui diversi da gemelli identici che possono condividere la stessa combinazione di sequenze di HLA. Mentre avanzate tecnologie per la tipizzazione HLA e sequenziamento diretto precisamente è in grado di catturare qualsiasi mancata corrispondenza nella sequenza di DNA tra un donatore e HLA del destinatario, il dosaggio di SAB, a causa della sua limitata varietà nella rappresentazione di sequenza, è in grado di rilevare con precisione gli alloanticorpi specificamente contro il donatore HLA mismatches. Abbiamo cercato di sviluppare un metodo complementare, utilizzando una tecnologia diversa per rilevare e caratterizzare gli anticorpi HLA anti-donatori su base personalizzata. Lo strumento di screening è una matrice su ordinazione del peptide donatore HLA-derivato di sequenze di per sondaggio post-trapianto sieri del destinatario dell’organo per valutare il rischio di rigetto anticorpo-mediato. Su un singolo array per una coppia donatore-ricevente, fino a 600 unici peptidi sono realizzati sulla base sequenze di proteine HLA del donatore, ogni peptide portando almeno un residuo non corrispondente in una sequenza 15-amino acida. Nei nostri esperimenti pilota per confrontare modelli di antigene per sieri pre- e post-trapianto su queste matrici, siamo stati in grado di rilevare i segnali anti-HLA con la risoluzione che ci ha permesso di individuare gli epitopi immuni coinvolti. Questi personalizzato antigene array permettono il rilevamento ad alta risoluzione degli epitopi HLA del donatore-specific nel trapianto dell’organo.
Introduction
Terapia del rimontaggio dell’organo che ordinariamente viene condotta in tutto il mondo ha salvato milioni di vite. Trapianto di organo solido si verifica in circa 100 pazienti per milione di persone negli Stati Uniti ogni anno, mentre un numero maggiore sono ancora su liste d’attesa per ricevere i donatori di organi a causa di una grave carenza di approvvigionamento (secondo le informazioni fornite dall’organo Appalti e rete di trapianto – OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov). Trapianto d’organo è altamente regolamentato al fine di ridurre gli sprechi di organo e salvare vite umane, ma gli strumenti scientifici utilizzati per informare questi regolamenti sono limitati in efficacia. Per esempio, la comunità scientifica riconosce pienamente gli Stati altamente polimorfici di molecole HLA e accurati test genetici del DNA mediante battitura a macchina ad alta risoluzione e basato su sequenze digitando (SBT) sono state sviluppate in anni recenti1, 2. Tuttavia, i metodi di collaudo alloanticorpo non sono ancora stati in grado di produrre la vasta gamma di singole sequenze HLA come sonde di antigene. Il test standard al giorno d’oggi utilizza un pannello invariabile di ~ 100 antigeni allelico che sono costituiti da comuni varianti di HLA, A, B, C, DQ, DP e DR sequenze in popolazioni umane3,4,5,6. Frequentemente, sequenze di HLA del donatore effettivo non sono inclusi nel pannello test, costringendo trapianto di medici e chirurghi di dedurre la reattività di donatore-specific sulla base di somiglianze condivise tra donatore effettive sequenze e corrispondenti “standard” nella test kit7,8. Di conseguenza, a volte è difficile fare una stima affidabile del rischio di rifiuto basato su anticorpo prova Risultati9,10,11,12. Di conseguenza, nuove personalmente test personalizzabili per gli alloanticorpi sono urgentemente necessari13,14.
I geni HLA codificano per i recettori (MHC) del complessi maggiore di istocompatibilità hanno una funzione chiave nella risposta immunitaria6. Geni HLA sono conosciuti per essere i più polimorfici geni del genoma umano6. A causa della rapidi progressi nel DNA sequencing strategie per i geni HLA, nuove varianti alleliche (o semplicemente indicati come alleli) vengono scoperti in un esplosivo tasso15,16. Entro il marzo 2017, 16.755 convalidati alleli erano stati depositati al Database IMGT/HLA (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html), di cui 12.351 erano di classe I e 4.404 erano dei gruppi II classe. In netto contrasto, solo poco più di 100 alleli distinti sono rappresentati nel test standard single-antigene Perline (SAB), che è usato ordinariamente per rilevare gli alloanticorpi nel trapianto dell’organo. Il metodo di RFA è costruito su una piattaforma Luminex mediante citometria a flusso. Poiché il test utilizza un set di invariabile di antigeni, a parte minore variabilità di lotti in produzione, la prova di antisiero può essere standardizzata robustamente tra individui e tra laboratori5. Tuttavia, questo test è in grado di catturare tutti gli alloanticorpi sviluppati specificamente contro gli alleli dei donatori, in particolare quando le sequenze del donatore sono assenti dal SAB set. Anche se la produzione personalizzata di antigeni dei donatori basato su sequenze veri sono desiderabili, restano sfide tecniche in procedure di collaudo e di razionalizzare la produzione necessaria.
Recentemente abbiamo descritto una metodologia alternativa in uno studio di fattibilità del trapianto renale soggetti17. Il metodo utilizzato gli antigeni peptidici in un formato di matrice per il sondaggio pre- e post-trapianto sieri di soggetti individuali. Ogni matrice è stato personalizzato costruito utilizzando il punto sintesi metodo18,19,20,21,22,23 che produce antigeni peptidici, ogni 15 amminoacidi di lunghezza, interamente basato su alleli HLA del donatore dell’organo rispettivo di A, B, C, DQA1, DQB1 e DRB1. Sintesi SPOT sono operato su una membrana di cellulosa con standard Fmoc-chimica22 e possono produrre centinaia di peptidi personalizzati in parallelo con un sistema completamente automatizzato robot19,21. La matrice di membrana possa sopportare vari cicli di spogliatura e reprobing cicli. Nel nostro studio retrospettivo17, abbiamo rilevato i cambiamenti nei modelli di antigene con antisieri stored trapianto raccolti in una serie di tempo (cioè, prima e dopo il trapianto). Qui descriviamo il protocollo tecnico per il flusso di lavoro tra cui progettazione, produzione, analisi di sondare e risultato di antisiero. Il metodo è destinato per il rilevamento di alloanticorpi contro epitopi specifici lineari su molecole HLA dei donatori del trapianto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il design della matrice SPOT descritto qui è per lo studio sperimentale della specificità alloanticorpo nel trapianto contro gli antigeni HLA del donatore di organi. In contrasto con il dosaggio SAB esistente ampiamente utilizzato in clinica, il metodo di matrice di antigene ha un grande vantaggio nel suo design flessibile che può ospitare le vere sequenze HLA del donatore individuale. La nuova piattaforma sfrutta le potenzialità della tecnologia di sequenziamento del DNA rapido avanzamento che sarà presto in grado …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la d. ssa Shawn Li e Li Xing della Western University in Canada per la loro assistenza gentile con SPOT produzione di matrice. Siamo grati ai membri del personale presso il nucleo di istocompatibilità e presso la completa Transplant Center della Northwestern University per la fornitura di servizi di esempio. Questo lavoro è stato parzialmente supportato da ausiliari Board di Northwestern Memorial Hospital e da un fondo di avvio facoltà forniti dalla Northwestern University di J.J..
Materials
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | |
| Non-fat milk | Bio Rad Laboratories | 1706404 | |
| TBST | Santa Cruz Biotechnology | 10711454001 | |
| Goat anti-human IgG–HRP | ThermoFisher Scientific | A18811 | |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad Laboratories | 1705061 | |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientifics | 21059 | |
| ChemiDoc gel imaging system | Bio Rad Laboratories | 1708265 |
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