Uoverensstemmelser i menneskelig leukocytter antigen (HLA) sekvenser mellom organtransplantasjon og mottaker parene er den viktigste årsaken til antistoff-mediert avvisning i organtransplantasjon. Her presenterer vi bruk av egendefinerte antigen matriser som er basert på individuelle givere HLA sekvenser å undersøke anti-giver HLA alloantibodies i orglet mottager.
I organtransplantasjon stole funksjonen og levetid av graftet kritisk på suksessen til kontrollere immunologiske avvisning reaktivitet mot menneskelig leukocytter antigener (HLA). Histocompatibility retningslinjene er basert på laboratorietester av anti-HLA immunitet, som viser enten som eksisterende eller de novo generert HLA antistoffer som utgjør en stor transplantasjon barriere. Dagens testene er bygget på en enkelt-antigen perler (SAB) plattform med en fast ~ 100 forhåndsvalgt rekombinant HLA antigener for å undersøke transplantasjon sera. Men hos mennesker finnes det et større utvalg av HLA typer, med ingen to personer enn identiske tvillinger som kan dele den samme kombinasjonen av HLA sekvenser. Mens avanserte teknologier for HLA å skrive og direkte sekvensering kan nettopp fange noen uoverensstemmelser i DNA sekvens mellom en donor og mottakerens HLA, SAB analysen, på grunn av sin begrensede variasjon i sekvens representasjon, er nettopp finner alloantibodies spesielt mot giveren HLA samsvarer. Vi søkt å utvikle en utfyllende metode som bruker en annen teknologi å oppdage og karakterisere anti-giver HLA antistoffer på et personlig basis. Screening verktøyet er en egendefinert peptid rekke donor HLA-avledet sekvenser for leting etter transplantasjon sera orgel mottakerens å vurdere risikoen for antistoff-mediert avvisning. På en matrise til et donor-mottaker par, er opptil 600 unike peptider gjort basert på donor HLA protein sekvenser, hver peptid bærer minst ett umake rester i en 15-amino acid. I vår piloten eksperimenter sammenligne antigen mønstre for pre- og etter transplantasjon sera på disse kjedene, kunne vi oppdage anti-HLA signaler med oppløsningen som også tillatt oss å presisere immune epitopes involvert. Dette personlig antigen matriser tillate høyoppløselig påvisning av donor-spesifikke HLA epitopes i organtransplantasjon.
Orgel erstatning terapi som utføres rutinemessig over hele verden har reddet millioner av liv. Solid organtransplantasjon oppstår i ca 100 pasienter per millioner mennesker i USA årlig, mens et større antall fortsatt er på ventelistene motta donor organer på grunn av en alvorlig mangel på forsyning (i henhold til informasjon gitt av orgelet Innkjøp og transplantasjon nettverk – OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov). Transplantasjon er sterkt regulert for å redusere orgel avfall og redde liv, men vitenskapelige verktøyene brukes til å informere forskriften er begrenset i effektivitet. For eksempel, det vitenskapelige samfunnet fullt gjenkjenner svært sammensatte statene HLA molekyler og nøyaktig genetiske tester av DNA med høy oppløsning skrive og sekvens-baserte skrive (SBT) har blitt utviklet i de senere år1, 2. men alloantibody testmetoder har ennå ikke kunne produsere det enorme mangfoldet av personlige HLA sekvenser som antigen sonder. Standard testen i dag bruker en ufravikelig panel av ~ 100 allel antigener som består av vanlige varianter av HLA, A, B, C, DQ, DP og DR sekvenser i menneskelige populasjoner3,4,5,6. Ofte faktiske donor HLA sekvenser er ikke inkludert i testpanelet tvinger transplantasjon leger og kirurger å antyde donor-spesifikke reaktivitet basert på delte likheter mellom donor faktiske sekvenser og tilsvarende “standarder” i den test satt7,8. Derfor er det noen ganger vanskelig å gjøre en pålitelig estimering av avvisning risiko basert på antistoff test resultater9,10,11,12. Ny personlig tilpassede tester for alloantibodies er derfor presserende behov13,14.
HLA genene kode av store histocompatibility kompleks (MHC) reseptorer som har en viktig funksjon i immunreaksjoner6. HLA gener er kjent for å være mest polymorfe gener i det menneskelige genom6. På grunn av de raske fremskritt i DNA sekvensering strategier for HLA genene, nye allel varianter (eller bare kalt alleler) blir oppdaget på en eksplosiv rate15,16. 16,755 godkjente alleler hadde blitt satt til IMGT/HLA databasen (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html), av hvilke 12,351 var klassen jeg mars 2017, og 4,404 var av klasse II grupper. I sterk kontrast representeres bare litt over 100 forskjellige alleler i standard enkelt-antigen perler (SAB) analysen, som rutinemessig brukes til å oppdage alloantibodies i organtransplantasjon. Metoden SAB er bygget på en Luminex plattform benytter flowcytometri. Siden analysen benytter en ufravikelig rekke antigener, bortsett fra mindre parti til parti variabilities i produksjon, kan den antiserum testen robust standardiseres på tvers av individer og laboratorier5. Denne testen er imidlertid å fange alle alloantibodies utviklet spesielt mot donor alleler, spesielt når donor sekvensene er fraværende fra SAB. Selv om egendefinerte produksjon av givere antigener basert på sanne sekvenser er ønskelig, fortsatt det tekniske utfordringer i effektivisere den nødvendige produksjonen og testing prosedyrer.
Vi har nylig beskrevet en alternativ metode i en mulighetsstudie nyre transplantasjon fag17. Metoden brukes peptid antigener i matrisen format for undersøkelser før og etter hårtransplantasjon sera i enkelte fag. Hver matrise var tilpasset bygget med SPOT syntese metoden18,19,20,21,22,23 som produserer peptid antigener, hver 15 aminosyrer i lengde, utelukkende basert på de respektive organtransplantasjon HLA alleler a, B, C, DQA1, DQB1 og DRB1. SPOT syntese drives på en cellulose membran bruker standard Fmoc-kjemi22 og kan produsere hundrevis av egendefinerte peptider parallelt med en fullt automatisert robot-system19,21. Membran matrisen tåler flere runder med stripping og reprobing sykluser. I vår retrospektiv studie17, vi har oppdaget endringer i antigen mønstre med lagrede transplantasjon antisera samlet i en tidsserier (dvs. før og etter transplantasjon). Her beskriver vi teknisk protokoll for arbeidsflyten inkludert matrise design, produksjon, antiserum undersøkelser og resultater analyse. Metoden er beregnet for å oppdage alloantibodies mot bestemte lineær epitoper på transplantasjon givere HLA molekyler.
I stedet matrisen beskrevet her er for eksperimentelle studier av alloantibody spesifisitet i transplantasjon mot en organtransplantasjon HLA antigener. I motsetning til eksisterende SAB analysen bredt brukt i, har antigen matrise metoden en stor fordel i fleksible utformingen som rommer den sanne HLA sekvenser av enkelte donor. Den nye plattformen utnytter mulighetene for den raskt fremrykkende DNA sekvensering teknologien som vil snart kunne produsere nøyaktige HLA allel sekvens målinger uten tvetydighet<sup class='x…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Shawn Li og Xing Li Western University i Canada for deres type hjelp med SPOT array produksjon. Vi er takknemlige for personalet Histocompatibility kjernen og det omfattende transplantasjon sentrum av Northwestern universitetet for å gi utvalg tjenester. Dette arbeidet har vært delvis støttet ekstra bord i nordvestlige Memorial Hospital, og et fakultet oppstart fond fra Northwestern University til JJ.
Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | |
Non-fat milk | Bio Rad Laboratories | 1706404 | |
TBST | Santa Cruz Biotechnology | 10711454001 | |
Goat anti-human IgG–HRP | ThermoFisher Scientific | A18811 | |
Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad Laboratories | 1705061 | |
Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientifics | 21059 | |
ChemiDoc gel imaging system | Bio Rad Laboratories | 1708265 |