Summary
所描述的 rna原位杂交协议允许检测整个果蝇胚胎或解剖组织中的 rna。使用96井孔板和 tyramide 信号放大, 记录可以检测高分辨率, 灵敏度和吞吐量, 并以较低的成本。
Abstract
在我们的努力, 以确定的表达模式和亚细胞定位的果蝇rna 在全基因组的基础上, 并在各种组织, 我们已经开发了许多修改和改进, 我们原来的荧光原位杂交 (鱼) 协议。为了方便吞吐量和成本效益, 所有步骤, 从探头生成到信号检测, 都是使用外显子 96-孔板。Digoxygenin (挖掘)-标签反义 RNA 探针的生产使用的是 cDNA 克隆或基因组 DNA 作为模板。在组织固定和性后, 探针杂交到感兴趣的抄本, 然后用一系列抗性的抗体结合生物素, 亲和共轭辣根过氧化物酶 (HRP) 和荧光共轭tyramide, 在 HRP 的存在下, 产生一个高度反应性的中间体, 结合到紧邻的蛋白质的电子密集区域。这些放大和定位步骤产生了一个强大的和高度本地化的信号, 有利于细胞和亚单元转录定位。所提供的协议经过了优化, 可以在各种组织和发育阶段产生高度特异的信号。此外, 还提供了额外的变异, 同时检测多个成绩单, 或抄本和蛋白质。
Introduction
新的全基因组 rna 检测方法, 如 rna 序列, 极大地扩展了我们对何时何地表达基因的认识, 以及在什么级别的1。然而, 这些提供了相对较差的时间和空间分辨率。RNA 原位杂交允许在固定组织中视觉上观察转录物的空间分布, 从而揭示细胞和亚型本地化2的细节。使用荧光原位杂交 (fish) 允许更多的空间分辨率, 因为它允许使用强大的显微镜技术, 如共焦和光片显微镜3。荧光标记 (如 DAPI) 也可用于建立亚细胞关系4。鱼类还有助于观察多个 rna 和蛋白质同时有明确的重叠在亚细胞水平的迹象。double-labeling 所需的独特试剂和步骤可在以下参考资料3,5中找到。
这里描述的程序利用96井孔板的所有步骤, 包括 cDNA 模板生产 (菌落 PCR), RNA 探针生产 (使用 T7, T3 或 SP6 聚合酶依赖性径流转录),原位杂交,荧光信号的发展。在96井板的每个井中加入足够数量的胚胎或组织, 以便评估一致性和变异性。每一个井然后接受不同的探针。信号发育后, 每个井中的胚胎或组织都在各自的显微镜切片上排列, 进行显微分析。
使用 tyramide 信号放大 (TSA) 进行探针检测产生了具有特殊的亚细胞分辨率5,6,7,8的鲁棒信号。rna 的亚细胞定位是一个重要的调节机制9 , 它出现在几乎所有 rna 的4、10、11中。这些分析还显示, 许多未被 RNA 序列检测到的记录被鱼8轻易检测到。RNA 的适应原位杂交到96井板允许分析最多96基因的兴趣 (如果更多的板块被使用), 使得分析大数据集成为可能。通过将板块切割成更小的部分, 这种方法也很容易适应少数样品。所提供的协议适用于大多数类型组织中 RNA 分布的分析。虽然没有显示, 它也适用于非果蝇组织。
Protocol
1. pcr 扩增质粒的 cDNA 模板
注意: 使用高质量的质粒或 pcr 生成的 DNA 模板进行 RNA 探针合成。由伯克利 果蝇 基因组项目生成的 果蝇 基因库 (DGC) 库提供了在 果蝇 基因组中发现的大多数编码基因的覆盖率 (见表 1a)。这些还允许使用普遍引物放大任何 cDNA 插入。这些 PCR 放大是在质粒 dna 中存在的质粒的裂解细菌培养。然后, DNA 产品被用作 体外 转录的模板, 生成反义 RNA 探针 (见表 1b).
- 设计引物通过 PCR ( e. g 从基因组 DNA) 放大感兴趣基因的特定外显子区域, 最好是在反义端的 T7 聚合酶识别站点上.
- 对于少于96样本的实验, 切掉不需要的96个板的部分。盖板与密封胶带 (见材料) 的所有孵化和存储。如果使用离心管, 请相应地调整音量.
注:96-井板允许使用多通道管增加吞吐量, 以及较小的体积, 以节省成本.
表 1a | ||||
抗生素 工作浓度 1:1000 |
引物 | rna 聚合酶 为 反义 | rna 聚合酶.
对于 感官 | |
pFLC | 放大 | pBst_SK (-) _F/R | T3 | T7 |
放大器 | pBst_SK (-) | T7 | T3 | |
氯 | pOT2_F/R | SP6 | T7 | |
pOTB7 | 氯 | pOT2_F/R | T7 | SP6 |
表 1b | ||||
入门 | 序列 | |||
pOT2_Forward | 5 和 #39;-AAT-GCA-GGT-TAA-CCT-GGC-TTA-TCG-3 和 #39; | |||
pOT2_Reverse | 5 和 #39;-AAC-GCG-GCT-ACA-ATT-AAT-ACA-TAA-CC-3 和 #39; | |||
pBst_SK (-) _Forward | 5 和 #39;-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-ATG-ATT-ACG-CC-3 和 #39; | |||
pBst_SK (-) _Reverse | 5 和 #39;-CGG-CCA-GTG-AAT-TGT-AAT-ACG-ACT-C-3 和 #39; |
表 1: A) 一般 DGC 克隆信息, 用于在质粒中放大 cDNA 插入物。B) DGC 质粒的通用引物序列.
- 在96个培养皿中增加250和 #181; 通过添加240和 #181, 对 LB 培养基中的细菌培养 l 进行适当的抗生素选择 (1:1000 稀释 1000 X 抗生素库存), 以及10和 #181; 原始的 l含有质粒的细菌 (从甘油库存)。密封胶带.
- 在37和 #176 中以 215 rpm 的抖动进行孵化; 在夜间 (O/N).
注: 制作一份新的细菌甘油 cDNA 质粒克隆砧木以取代原来的。不要冻结原始细菌的库存, 因为这可能会杀死细菌. - 生产 pcr 模板, 稀释10和 #181; 90 和 #181 中的 O/N 细菌培养 l; 高压蒸 ddH 2 在一个新的96井 pcr 板的每个井中的每一个的 o。变性的 DNA 为5分钟, 在95和 #176; C thermocycler。立即把盘子放在冰上至少5分钟.
- 使用适当的通用引物制备 PCR 反应, 每表 2.
试剂 | 50 和 #956; 示例响应 | 96 井混音 (112x反应) | 最终浓度 |
25 和 #956; | 2800 和 #956; l | 1 x | |
0.5 和 #956; l | 56和 #956; | 0.25 pmol/和 #956; l | |
Primer_Rev (25 pmol/和 #956; l) | 0.5 和 #956; l | 56 和 #956; l | 0.25 pmol/和 #956; |
ddH2O | 22 和 #956; l | 2464 和 #956; l | /tr > |
总计 | 48 和 #956; l | 5376 和 #956; l |
表 2: 聚合 PCR 主组合.
- 使用吸管、分48和 #181; pcr 大师的 L 混合到一个新的96井 pcr 板的每个井。每井添加2和 #181; 每个变性质粒 DNA 模板 L.
注: 使用 1 picogram (pg) 至1克 (ng) 质粒 DNA。过量的 DNA 模板降低了 PCR 的产量和特异性. - 按表3编程96井 PCR 机并进行放大.
注: 延长时间在72和 #176; C 是由 PCR 产品的大小 (四十五年代为和 #8804; 2.0 kb, 1.5 min 为和 #8804; 3.0 kb, 3 min 为和 #8804; 4.0 kb 和 3.5 min 4.0-5.0 kb)。退火温度 (Tm) 由引物序列确定。当底漆等于或超过 20 nt 时, tm 被计算为:
tm (和 #176; C) = (4 x 的 CG 数) + (2 x 的个数)-4.
步骤 | 温度 | 时间的 | |
初始变性 | 95 和 #176; c | 3 分钟 | 1 循环 |
放大 变性, 退火和扩展 | 95 和 #176; c | 45 秒 | td 行跨度 = "3" > 30 周期|
54-58 和 #176; c | 45 秒 | ||
45 sec-3.5 分钟 | |||
72 和 #176; c | 7 分钟 | 1 循环 | 4 和 #176; C | 保留 |
表 3: 推荐的 PCR 程序.
- PCR 产品沉淀与乙醇 (乙醇) 和乙酸钠 (NaOAC) (见表 4).
注: 如果 PCR 反应体积小于 50, #181; l, 填充50和 #181; l 与 ddH 2 O。- 来沉淀 DNA 将表4中的组件和存储样品在-20 和 #176; c 或30分钟在-80 和 #176; c. 离心 96-井板45-60 分钟 2250 x g at 4 和 #176; c. 使用8通道流形吸管到 carefully 除去上清液。用160和 #181 冲洗一次, 70% 乙醇 (核糖核酸), 30 分钟, 2250 x g 在4和 #176; C.
注: 沉淀的 DNA 可以在井底看到。更短的 PCR 产品需要更长的 centrifugations. - 在纸巾上轻轻地倒置96井板, 以去除每个井中的最后一滴液体 (尽可能多地)。室温下空气干燥的 DNA 颗粒 1 h (RT)。重25和 #181 的沉淀 DNA; 我核糖核酸免费的水.
注: 1 小时空气干燥将允许所有的乙醇蒸发的痕迹。然而, 一小体积的液体 (约1和 #181; L) 应保持在每井, 以防止 DNA 颗粒完全干燥。使用25和 #181; l 为50和 #181; l PCR 反应。在这一阶段不要使用 DEPC 处理过的水, 以避免与 体外 转录在以下步骤中的干扰.
- 来沉淀 DNA 将表4中的组件和存储样品在-20 和 #176; c 或30分钟在-80 和 #176; c. 离心 96-井板45-60 分钟 2250 x g at 4 和 #176; c. 使用8通道流形吸管到 carefully 除去上清液。用160和 #181 冲洗一次, 70% 乙醇 (核糖核酸), 30 分钟, 2250 x g 在4和 #176; C.
组件 | 音量 | 部分 |
PCR | 50 和 #956; l | |
100% 乙醇 | 125 和 #956; l | 2.5 X vol. pcr |
3M NaOAc (pH = 5.2, 核糖核酸自由) | 5 和 #956; | 10% vol. pcr |
总 | 180 和 #956; l |
表 4:50 和 #181 的示例; PCR 反应.
- 通过运行5和 #181 来检查 PCR 产品的大小和产量; 悬浮 DNA 溶液在 1 X 泰缓冲区的1% 琼脂糖凝胶中的 L.
注:15 和 #181 共需要 250-500 ng DNA 模板; L 体外 转录反应。产量较高的样品可以进一步稀释。RNA 的产量也取决于 DNA 模板的序列和长度。根据 T7 rna 聚合酶的挖掘 rna 标记的一般指南, 大约10和 #181; g 的挖掘标记 rna 是生产从1和 #181; g 线性化的模板.
2。 体外 转录生成反义探针.
注意: 在无核糖核酸的环境中工作是至关重要的。所有试剂和实验室洁具必须核糖核酸免费 (如认证 dnasei/核糖核酸免费塑料制品).
组件 | 库存集中 | 卷 | 最后的浓度 |
ATP | 100 mm | 7 和 #956; l | 10 mm |
CTP | 100 mm | 7 和 #956; l | 10 mm |
100 mm | 7956; l | 10 mm | |
UTP | 100 mm | 4.5 和 #956; l | 6.5 mm |
10 mm | 25 和 #956; l | 3.5 mm | |
>> | 19.5 和 #956; l | ||
全部 | 70 #956; |
表 5: 挖掘-NTP 混合准备. 表边框 = "1" fo: 保持在一起. 在页内 = "1" fo: 保持-下. 在页内 = "始终" >
表 6: 2X 转录主组合.
- 准备按表5的挖掘-NTP 组合.
注意: 为了避免错误, 总是对齐板, 这样, A1 是在左上角的板块. - 将表6中所描述的组件添加到一个新的96井 PCR 板 (探针板) 中。使用多通道吸管将 PCR 产物 (DNA 模板) 的7.5 和 #181 L 添加到每个相应的井中。用密封胶带盖板.
注: 每转录反应所添加的 PCR 产物的最佳用量应介于0.5 至1和 #181 之间;如果凝胶上的带子明显较弱或更强烈, 则添加到反应中的 DNA 量可以相应地调整。确切的金额并不重要. - 在37和 #176 孵育探头板; C 为 3.5-4 h. 混合15和 #181; l 的合成探针与35和 #181; DEPC 处理 ddH 2 O, 125 和 #181; l 100% 乙醇, 和5和 #181; l 3 M NaOAC (pH = 5.2, 核糖核酸自由)。存储在-80 和 #176; C 为至少30分钟离心和洗涤, 如步骤1.10.2 和1.10.3 所述.
- 重25和 #181 中的沉淀探头; DEPC 处理 ddH 2 o. 运行5和 #181; l 在1% 琼脂糖凝胶 (运行时间和 #60; 20 分钟) 检查探头的完整性和成品率 ( 图 2 ).
注: 琼脂糖凝胶必须与 DEPC 处理的 ddH 2 O 和泰缓冲器。凝胶电泳仪只应分配给 RNA 工作。更长的凝胶运行时间在低速可能导致 RNA 退化在电泳期间. - 将余下的20和 #181; 合成探针的 l 与100和 #181; l 杂交解决方案 (表 7) 和存储在-80 和 #176; C, 直到需要.
注意: 如果频带特别健壮, 探头浓度可以稀释更多 (请参见 图 2 中的示例)。杂交解决方案是非常有效的防止核糖核酸污染。立即加入杂交解决方案的悬浮探针, 以避免 RNA 降解。杂交解决方案必须通过0.2 和 #181; m 过滤器过滤。对于组织样本, 增加 Triton-X-100 的浓度为 0.3%, 以提高杂交溶液中的洗涤剂浓度.
组件 | 音量 | 最终集中 |
DEPC 处理 ddH2O | 11.85 ml | 23.7% |
20 X SSC | 12.5 ml | 25% (5 X) |
甲酰胺 | 25 ml | 50% |
肝素 (50 毫克/毫升) | 0.1 ml | 0. 2% (0.1 毫克/毫升) |
鲑鱼精子单绞 DNA | 0.5 毫升 | 1.0% |
Tween-20 | 0.05 ml | 0.1% |
总计 | 50.00 ml | 100% |
3. 果蝇 饲养和胚胎、幼虫和成人组织收集.
注意: 对于小规模 (瓶子) 和质量 (盒) 的苍蝇饲养, 使用标准的苍蝇实验室协议的玉米为基础的食物在25和 #176; c. 保持适当的成人和幼体密度, 并提供额外的活性酵母粉的食物曲面.
- 根据标准协议收集胚胎。在 图 3 中说明了胚胎采集的主要步骤.
注: 在甲醇中冲洗 devitillinized 胚后, 固定胚胎可储存在-20 和 #176; C 为一年。胚胎性和 post-fixation 在《鱼类议定书》1天执行. - 准备新的40% 粉煤灰库存解决方案。
- 通过将10毫升 DEPC 处理的 ddH 2 O 与3.68 克粉煤灰和70和 #181 混合, 准备一个新制作的40% 甲醛 (粉煤灰) 的库存解决方案. 2N KOH 在一个20毫升玻璃闪烁瓶中含有一个小的轰动酒吧.
注意: 粉煤灰具有剧毒, 具有潜在的急性和慢性健康影响。阅读 MSDS (材料安全数据表), 并使用适当的保护眼睛, 皮肤和呼吸道. - 在通风罩内, 在200和 #176 的加热板上加热和搅拌瓶3-5 分钟, 直到粉煤灰完全溶解。一旦粉煤灰溶解 (不要过热), 从热中除去粉煤灰库存溶液.
- 冷却溶解在冰上的40% 粉煤灰库存解决方案5分钟, 并过滤0.2 和 #181; m 过滤器和10毫升注射器.
- 通过将10毫升 DEPC 处理的 ddH 2 O 与3.68 克粉煤灰和70和 #181 混合, 准备一个新制作的40% 甲醛 (粉煤灰) 的库存解决方案. 2N KOH 在一个20毫升玻璃闪烁瓶中含有一个小的轰动酒吧.
- 第三龄幼虫 (L3) 或成人组织固定、淬火和性 注意: 此协议应在一天内完成。包括组织解剖、固定、内源性 HRP 猝灭、性和 post-fixation。
- 按照表8准备修复解决方案 (修复 i 和修复程序 II).
注: 苦味酸酸是一种额外的固定剂, 当组织有一个微妙的结构, 必须保存。当组织超微结构必须保存在电子显微镜 (EM) 中时, 它不是一个好的定影剂.
警告: 苦味酸酸是不稳定的, 有能力与其他材料的反应和制造爆炸性化合物。根据安全准则使用和存储. - 将幼虫或成人苍蝇放在50毫升的塑料管中, 其中含有10毫升的冷 1 X PBS 和100和 #181; 我的解决方案冰镇2分钟, 减少幼虫或成人的飞行动力.
- 切断1毫升塑料尖端的尖端, 以创建一个2-3 毫米的开口。将10-30 只幼虫或成人苍蝇与1毫升尖端转化为培养皿 (9 厘米直径), 从50毫升管 (步骤 3.3.2) 的浅层 1 X PBS。加入少量的 PBTT 可以降低表面张力。在解剖范围内仔细解剖幼虫 (从前到后挤压组织, 从后向前) 或成人组织的兴趣与锋利的镊子.
注意: 大约有200-300 幼虫或成人睾丸可由有经验的人在一天内解剖和固定. - 用200和 #181 转移解剖组织; L 吸管 (与尖端切断, 创造一个2毫米直径开口) 成1.5 毫升管和储存在冰上。10-15 分钟内完成每一次解剖, 然后再前进到下一步.
注: 继续进行额外的回合 (在一个2小时的时间窗口内), 以产生足够的材料需要. - 用800和 #181 修复组织; 在一台台式搅拌机上安装30分钟固定解决方案 L。用800和 #181 冲洗组织一次; L 1 X PBTT, 并在冰上保持管最高2.5 小时. 由于30极小的极限, 这需要进行间歇, 直到有足够的组织已经收集.
- 将所有解剖和固定组织放入一个15毫升塑料管中, 其中包含盖子的网格 (请参见 图 4 用于管设计)。通过管盖上的网孔吸出多余的液体。洗 3 x 5 分钟, 每10毫升 1 x PBTT。冲洗两次, 用10毫升 1 X PBS 去除洗涤剂。这可以防止下一步中出现多余的气泡.
注: 如果解剖的组织下沉到底部的管, 步骤可以执行在常规孔板或 0.5-1.5 毫升离心管 (300-800 和 #181; L 体积每管). - 在 RT 中为 15 min, 在 PBS 中对 5 mL 0.3% H 2 O 2 内源性 HRP 活动进行淬火. 重复一次。在这一步保持盖子打开, 不混合。用10毫升 1 X PBTT 冲洗两次。洗两次5分钟, 10 毫升 1 X PBTT.
- Permeabilize 组织10毫升80% 丙酮 (-20 和 #176; c, pre-chilled) 在-20 和 #176; c 为 10 min. 在潜伏期两次倒置管。洗两次10分钟, 10 毫升 1 X PBTT 水化组织.
- 用5毫升 PBTT + 5 毫升杂交溶液 (1:1) 的10毫升混合液冲洗. #160;D iscard 混合, 替换为 10 ml 杂交溶液。样品可以存储在和 #160;-20 和 #176; C 直到需要。为了取得最佳效果, 请不要将示例存储超过一周.
- 按照表8准备修复解决方案 (修复 i 和修复程序 II).
组件 | 修复 i (10 ml) | 修复 II (10 ml) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
40% 粉煤灰库存 | 1 ml | 1 ml | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PBTT | 8.99 ml | 9 ml | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
10 和 #956; l | nt "fo: 保持在一起. 在页内 =" 1 "> 表 8: 修复组织的解决方案.
4. 原位 杂交 注: 该协议的这一部分至少需要2天, 在1天进行样品制备、、和杂交, 并探测2天。如果样本数相对较高, 如果不熟悉该协议, 或全天不可能, 则应在3天内执行协议, 并将探头检测和信号放大的步骤划分为2天。大量的胚胎或解剖组织样本也可能需要额外的天数来处理。对于解剖组织样品, 更换 1 x PBT 和 #160; 1 x PBTT 在所有步骤, 除非另有说明。额外的洗涤剂是需要的渗透许多幼体和成人组织, 如大脑和睾丸。虽然没有测试, 1 X PBTT 也可用于胚胎。使用100和 #181; 96 井板和800和 #181; l 为1.5 毫升管.
5。探测检测
表 9: 杂交后冲洗探针.
6。使用 tyramide 的抗体检测 (请参见 图 5 ) 注意: 这里自制的菁3共轭 tyramide 被使用, 根据在 12 中描述的协议编写.如果做许多实验或测试许多样品, 这节省了大量的钱, 是有效的比商业试剂 (从经验)。为了减少实验和样品, 可以使用商业上可用的菁 3-tyramide (见材料).
Representative Results图 6显示了使用此过程获得的结果的示例。前3面板显示了早期的果蝇胚胎 (图 6, 面板 A-C) 的示例, 接下来的3面板显示了在不同组织 (amnioserosa、肌肉和中枢神经系统中有信号的晚期果蝇胚胎的示例。分别 (图 6, 面板 D-f)。接下来是第三龄幼虫组织的例子 (图 6, J 型面板)。K 和 L 组显示成人性腺 (卵巢和睾丸分别) 的代表性图像。在我们可搜索的 "荧光原位果蝇数据库" (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)) 上上载并标注了数以百计的图像。
Discussion所描述的协议为检测固定的果蝇胚胎或组织中的大多数 rna 提供了一种高度重现性、灵敏和经济的方法。虽然比传统的碱性磷酸酶探针检测方法稍微复杂一些, 但鱼获得的分辨率要大得多, 灵敏度是可比较或改进的7,8。通过使用整体或部分孔板, 该协议可用于 large-scale 或有限分析的兴趣基因。应该注意的是, 所生成的探针可能检测到所有或多个成绩单拼接形式, 除非探头更具体地设计 (即单显)。尽管我们已经测试了小到200核苷酸的探针, 但有合理的成功, 较小的探针往往不太有效, 而且可能不太具体。显然, 此协议不适用于检测小内含子、显或处理的 rna。 虽然这种方法使用酶的步骤, 以提高信号的强度, 信号强度似乎成正比的目标基因表达在一个相对线性和广泛的表达水平。在高倍率下, 信号被视为细胞和组织内的点或斑点。为相对地罕见的抄本仅少数微小的点被看见。随着成绩单的增多, 这些增长的数量和规模。与单分子鱼 (smFISH) 一样, 单个的小点也可以对应于单一的 rna, 并且还应该使用成像和信息学软件进行量化。使用 smFISH 与我们为同一目标所策划的图像进行对比, 表明这两种方法的整体性、灵敏度和分辨率是相对相似的, 尽管这应该通过更严格的比较来测试。鉴于 smFISH 的费用要高得多, 这里提供的方法应该以成本的一小部分给出类似的结果。然而, 如果目标是检测小的成绩单, 或不同部分的成绩单, 建议 smFISH。 由于一些鱼探头的体积较小, 这种方法在穿透组织大或有明显障碍的情况下也会更好。然而, 我们使用更高的洗涤剂水平和组织固定和性调整似乎解决了这个问题。最后, 虽然开发了为果蝇组织, 这里描述的高洗涤剂缓冲的组织也应该为果蝇胚胎以及大多数其他有机体和组织工作。 Disclosures作者没有竞争的金融利益。 Acknowledgments该项目的资金支助是由加拿大卫生研究所的 HMK 赠款提供的 (赠款拖把 133473)。 Materials
References
Tags遗传学 问题 128 RNA 亚细胞定位 荧光原位杂交 鱼 果蝇 高通量 tyramide 信号放大 胚胎 组织。 View VideoGet cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month. |