組換えタンパク質の部位特異的糖体外のシステインのチオール基を対象と

サマリー

糖タンパク質の生化学的および構造解析では、均質な試料の比較的大量を必要とします。反応システイン チオール化合物をターゲットに細菌から精製組換えタンパク質の部位特異的糖鎖の効率的な化学的方法を紹介します。

要約

間質相互作用分子 1 (STIM1) は型-私膜貫通型タンパク質は、小胞体 (ER) と膜 (PM) に位置しています。小胞体 STIM1 プリンシパル Ca^{2 +}シグナリング プロセスです免疫反応を駆動する作動させたカルシウム (Ca^{2 +}) のエントリを格納として知られているプロセスの午後 Orai1 チャネルの活性を調節します。STIM1 は、ドメイン内で Ca^{2 +}センサー分子の 2 つの内腔 Asn サイトで翻訳後修飾N- グリコシル化反応を受けます。しかし、生化学、生物物理、 Nグリコ STIM1 の構造生物学的効果が同種のN- 糖タンパク質の高レベルが容易に取得できないのため最近までよくわかっていないと。ここでは、特定の蛋白質サイト該当するタンパク質の構造と機構の糖鎖の根本的な効果を理解するために糖鎖のついた体外化学アプローチの実装について述べる.ソリューションの核磁気共鳴分光法を用いた単一サンプルのブドウ糖添付ファイルの構造の結果だけでなく、変更の両方の効率を評価する.このアプローチは、自然は、無数の糖蛋白質を研究する容易に適合できます。

概要

運営のカルシウム (Ca^{2 +}) を格納エントリ (SOCE) が主要な経路で、免疫細胞は、細胞質への細胞外スペースから Ca^{2 +}を取る。T リンパ球の細胞膜 (PM) に位置する T 細胞受容体は抗原蛋白質のチロシンのキナーゼ ( ^1,2,3見直し) を有効にするをバインドします。リン酸化カスケード ホスホリパーゼ-γ (PLCγ) その後ジアシルグリセ ロールとイノシトール 1,4,5-三リン酸 (IP_{3 にホスファチジルイノシトール 4, 5-ビスリン酸 (PIP2) 膜の加水分解反応を媒介するの活性化につながる}).IP₃は、IP₃受容体に結合 (IP₃R) 小胞体 (ER) にこの受容体チャネルを開くし、Ca^{2 +}を許可に流れる小胞体から濃度勾配を小さな拡散性メッセン ジャー(文献⁴) 細胞質へルーメン。受容体 G タンパク共役型とさまざまな他の興奮性および非興奮性細胞型鉛の受容体型チロシンキナーゼから IP₃の同じ生産し IP₃Rs の活性化。

プロトコル

1 ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR)-システインの細菌ペット-28 a の発現ベクターへの取り込みのサイト指示された突然変異誘発を介した。

。

1. 260 0.020 インチ (μ g/mL) cm ^-1 の紫外線 (UV) 吸光係数を使用してペット-28 a ベクトル (すなわち二重鎖 DNA) の濃度を決定する nm
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2. 合成の各の Cys 変異補完 mutagenic プライマーのペア 私) 一塁のミスマッチや 15 ヌクレオチド後テンプレートを補完する前にテンプレートを補完するもの 15 ヌクレオチドの最小値がある、最終的な基本の不一致、ii) の合計プライマー長さが 45 のヌクレオチドおよび iii を超えない) 各プライマー (表 1) の最初と最後のヌクレオチドの位置に、グアニン、シトシンあります。0.025 μmol スケールとカートリッジ精製を使用してプライマー合成を実行ことを確認します
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3. 高忠実度 DNA ポリメラーゼを使用して 2 つの 20 μ L の PCR 反応混合物を設定: 前方のプライマーと 2 番目の 1 つを含む逆プライマーを含みます。1.5 mM MgCl ₂、0.2 mM dNTPs、0.5 μ M のプライマー、0.4 μ DMSO、1 x PCR バッファーの最終濃度が含まれてそれぞれの混合物を準備 1.25 ng/μ L のテンプレ....

結果

このアプローチの最初のステップは、ブドウ糖 5 山地 EFSAM を使用して変更可能なことができるシステイン残基に候補糖残基の変異体には内因性のシステイン残基がないので特別な考慮事項を前に可能にする必要はありません必要があります、突然変異誘発。ただし、ネイティブのシステイン残基は、記述されている化学を実行する前に非変更可能な残基に変異する必要があります。ネイティブ構造体に影響を与える最低限、興味の蛋白質のグローバル配列アラインメントを実行する勧めし、他の残基であるを決定する最も頻繁で内因性システイン位置を発見しました。他の生物の自然発生するこれら他の残基に Cys 変異は蛋白質の構造の影響を最小限があります。内因性の Cys 残基は厳重に保存されている場合は、Cys に最も構造的に類似している Ser に書き換えることをお勧めします。図 1は、典型的な PCR の突然変異誘発ゲル PCR に使用された増幅されていないテンプレート ペット-28 a DNA 量制御よりも数倍高い強度を示す増幅された DNA のサンプ.......

ディスカッション

タンパク質の糖鎖修飾は翻訳後修飾糖が共有結合ポリペプチド アミノ酸側鎖に結合を通して主に接続されています。哺乳類のタンパク質の 50% がグリコ⁵⁴、どこ糖蛋白質は生体分子結合親和性を変更することから効果の多様な範囲を持つことができますその後、蛋白質折りたたみ、チャネルの利用状況の変更、ターゲットに影響を与える劣化と携帯 (³³の見直し) 少数を示すため、人身売買のための分子。哺乳類の生理学における糖鎖の重要な役割は、哺乳類の糖鎖構造³³最大限の多様性を構築する進化したタンパク質のいくつかの数百人が明らかです。N- を変更し、 O糖鎖修飾パターンと関連している前立腺の (増加・減少) の乳房 (増加・減少) など多数の病気の状態 (増加) の肝臓、卵巣 (増加)、膵臓 (増加)胃癌 (増加) ⁵⁵.さらに、huntingtin、タウの糖鎖 α-シヌクレインがアルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病の疾患<.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Phusion DNAポリメラーゼ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	F530S	ステップ1.3で使用します。
Generuler 1kb DNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	FERSM1163	ステップ1.6で使用します。
DpnI制限酵素	New England Biolabs, Inc.	R0176	ステップ1.8で使用します。
プレストミニプラスミドキット	ジーンエイド株式会社	PDH300	ステップ1.16で使用します。
BL21 DE3コドン(+) 大腸菌	アジレントテクノロジーズ(株)	230280	手順 2.1 で使用します。
DH5a 大腸菌	Invitrogen, Inc.	18265017	手順1.9で使用します。
0.22 mm シリンジフィルター	Millipore, Inc.	SLGV033RS	手順2.3で使用します。
HisPur Ni2+-NTAのアガロース樹脂	サーモフィッシャーサイエンティフィック	88221	ステップ3.3で使用。
3,500 da MWCO 透析チューブ	BioDesign, Inc.	D306	3.8、3.16、4.2、4.5、および4.6で使用します。
ウシトロンビン	バイオファームラボラトリーズ株式会社	SKU91-055	ステップ3.9で使用します。
5 mL HiTrap Q FF 陰イオン交換カラム	GE Healthcare, Inc.	17-5156-01	3.11で使用します。
グルコース-5-MTS	トロント・リサーチ・ケミカルズ社	G441000	手順4.1で使用します。
ビバスピン20限外ろ過遠心濃縮器	ザルトリウス株式会社	VS2001	ステップ 3.11、4.2、4.5、4.6 で使用します。
PageRuler 未染色ブロードタンパク質ラダー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	26630	ステップ3.7、3.10、3.15での使用
HiTrap Q FF 陰イオン交換カラム	GE Healthcare, Inc.	17-5053-01	3.12で使用します。
AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System	GEヘルスケア株式会社	29018224	手順3.14で使用します。
600 MHz Varian Inova NMR分光計	Agilent Technologies, Inc.		手順 5.2 と 5.5 で使用します。

ステップステップステップ