破骨細胞形成乳房癌細胞と共培養末梢血単球からの人間の前臨床モデルの開発
Summary
このプロトコルでは、生体外で人間前臨床モデルの末梢血単球培養がん細胞破骨細胞の相互作用を模倣する乳房癌細胞から破骨細胞形成の開発について説明します。モデルは、骨転移形成の理解を深めると治療オプションの改善される可能性があります。
Abstract
腫瘍細胞と骨の微小環境における骨細胞間クロストークは骨転移形成のメカニズムを理解することが重要です。体外完全ひと臨床のモデル乳癌細胞と破骨細胞への分化を受けている単球の培養を行った。私たちは健康なドナーから末梢血液のサンプルから破骨細胞形成のモデルを最適化されています。末梢血単核球 (PBMCs) が最初に密度勾配遠心法で区切られ、高密度で播種、2 つの成長因子 (GFs) を追加することによって区別するために誘導: 核因子 κ B ligand (RANKL) とマクロファージの受容体活性化コロニー刺激因子(MCSF)。セルが 14 日間文化のまま固定し、下流の分析を行った。骨骨転移における骨にがん細胞の到着の効果の 1 つは破骨細胞形成の誘導です。我々 はこのように私たち GFs に対するがん細胞の分化のパワーを研究する乳癌細胞の共培養モデルを挑戦しました。がん細胞破骨細胞の相互作用を学ぶ簡単な方法は、乳房癌細胞培養から収集し、新鮮な媒体と混合馴化培地の使用に基づく間接共培養を行うことです。この混合物は、破骨細胞分化を誘導するために使用されます。我々 はまた直接培養がん細胞と単球の分化を受けて媒体を共有し、分泌された要因を交換する方法を最適化されています。これは、大幅に改善オリジナル間接共培養法で研究者は 2 つの細胞のタイプの相互作用を観察でき、がん細胞と破骨細胞の両方に対する下流を分析します。この方法により、骨転移微小環境と乳がん由来以外の種細胞への薬の効果を研究します。モデルは、骨粗しょう症や他の骨の条件など他の病気を研究するも使用できます。
Introduction
骨は、病1,2,3の過程で骨転移を来した症例の 20-25% に前立腺、肺、乳癌などの癌の種類によって転移の一般的なサイトです。特に、乳がん患者の 70% は死4で骨転移の証拠を運ぶ。腫瘍と間質細胞癌の二次病変の相互作用は癌の進行に不可欠な。骨の微小乳がんから骨骨転移は、がん細胞、骨細胞、骨微小環境と発生病理学的悪循環の確立によって異なります。癌細胞は骨吸収5,6、7の増加、骨のバランスを混乱させます。
新しいマトリックスを入金で、骨芽細胞が新しい骨形成8担当に対し、正常および病的条件では、破骨細胞、骨吸収を担当のセルです。破骨細胞融合、成熟破骨細胞への分化に必要なプロセスを誘導するランク破骨細胞表面の受容体に結合する RANKL の発現を介して骨芽細胞による破骨細胞の活動が規制されています。破骨細胞形成の誘導には、骨吸収が増加します。多数の生体内で調査は大きく骨転移形成9,10,11の私達の理解を改善しています。乳癌細胞腫瘍と骨の微小環境では、破骨細胞形成を促進する破骨細胞機能を混乱させるし、骨吸収8。このシナリオではすべて分子間の相互作用が発生する癌細胞と破骨細胞が極めて重要です。すでに述べたように、骨転移のメカニズムは、 vivoマウス モデルに解明されてきた。ただし、すべて生体内で倫理委員会の動物実験の承認のための必要性に加えて、高いコストと時間のかかる方法を含む生体内で実験を実行するその他のいくつかの欠点があります。何人かの著者は、RAW246.79,10,11と呼ばれる前破骨細胞をマウスの線を使用して破骨細胞形成の生体内および生体外での前臨床モデルを組み合わせています。このモデルの欠点はセル前破骨細胞になることにコミットしているすでに、人間の起源ではないという事実に起因します。これらの理由から、トランスレーショナルリサーチ大幅体外骨癌細胞の相互作用を研究する完全ひと臨床モデルの可用性から寄与できます。
破骨細胞形成の in vitroひと末梢血サンプル12,13から始まってのメソッドを最適化されています。破骨細胞は単球は、末梢血サンプルの小さい程度に存在、してから派生します。単核球、最初で仕切られて赤血球と顆粒球全血中に存在 Ficoll 密度勾配;リンパ球とは異なり、プラスチック基板に付着する彼らの能力のおかげで彼らが選択されます。播種後 14 日間の細胞を培養しています。MCSF と RANKL は、GFs の単球がマクロファージと破骨細胞14,15に最初に区別するために必要です。RANKL は破骨細胞形成の後期段階の分化過程を誘導するために使用されるに対し、アッセイの全体の持続期間のため MCSF が必要です。分化の初期の段階で MCSF 単球増殖し、14,15を生き残ることができます。破骨細胞形成の 2 番目の部分の中に細胞が融合して破骨細胞、リングで F アクチンの分布特性を示し、酒石酸耐性酸フォスファターゼ (TRAP) やカルシトニン受容体などの特定のマーカーの表現として成熟(CTR)14,15. 本論文では 7 に 14 日から実験と MCSF と RANKL の組み合わせの最初の 7 日間の単球文化に MCSF を追加します。実験の終わりには、破骨細胞形成は下記のとおり、分化した細胞をカウントすることによって分析されます。
Gfs の区別するために誘発 monocyte 文化は、私たちの前臨床モデルの基礎を形成します。私たちは乳癌細胞の osteoclastogenic の力を理解する GFs なし共培養システムを最適化されています。メディアを追加することによって間接共培養モデルを開発した (80% α-最小必須培地 (α-MEM) エアコン 20% 中小収集乳癌細胞の文化から、セルを約 90% 合流分化12 を受けていた.馴化培地 (血清欠乏条件下では収集されません) は 24 時間後に収集され、新鮮な培地で 1:4 の割合で混合します。馴化培地には、負の制御に関して重要な破骨細胞の分化が誘導されます。しかし、な間接共培養を使用する場合、がん細胞と骨細胞間相互作用の情報が失われない、直接共培養を行うことで我々 のシステムを改善しました。0.4 μ M を挿入し、単核球がメッキされた井戸に配置しての癌細胞の種をまいた。このメソッドを使用すると、セルは同じ媒体を共有しから分泌されるタンパク質を交換します。こうしてがん細胞13による破骨細胞形成の完全に人間の臨床モデルを作りました。
このシステムは非常に汎用性と異なる研究目的、例えば、骨転移の薬の役割を調査し、薬理学的研究でに使用できます。私たちのモデルでは、有効性と骨標的療法および/またはがん細胞13の存在下で骨の微小環境における抗腫瘍薬の作用のメカニズムを研究することが可能になります。正しいコントロールを持つ実験の設計、すなわち、癌細胞と破骨細胞培養、個別にやすく薬剤活性の共培養の影響を理解します。この方法は、研究されている薬剤ターゲット癌細胞及び破骨細胞、例えば、エベロリムス両16時さらに興味深いものになります。このモデルは、がん細胞と骨細胞間の相互作用の新しい経路を識別するためにも使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
前臨床の in vitroモデルがん細胞と骨細胞間クロストーク機構の研究は、骨転移治療の新しい戦略を作成するためのメカニズムを識別するために必要です。ひと末梢血 (図 3) から破骨細胞形成の完全な人間の in vitroモデルを開発しました。方法論の最適化中に重要なポイントの数が特定し、解決されました。最初は、種子に単核細胞の量を懸念しています。?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SCP2 細胞株を提供するため Yibin Kang とクリスティアーノ ヴァーナ編集者の支援のために感謝したいと思います。
Materials
| αMEM | Euroclone | BE12-169F | |
| Glutamine | Life-technologies | ECB3000D | |
| Fetal bovine serum | Life-technologies | ECS0180DPR | |
| hMCSF | Peprotech | 300-25 | Storage indications must be respected |
| hRANKL | Peprotech | 310-01 | Storage indications must be respected |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma Aldrich | 387 A | |
| Lymphocyte separation media | Biowest | L0560-100 | |
| Red Blood cell lysing buffer | SIgma | 11814389001 ROCHE |
|
| Trypsin | EuroClone | COD. ECB3052D | |
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | CRM-HTB-267 | |
| MCF7 | ATCC | HTB-22 | |
| Transwell | Corning | 3470-Clear | These inserts are for 24-well plates; 6.5 mm, 0.4 μM; pore size |
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