Métodos para el pH intracelular de la proyección de imagen del linaje de la célula de vástago del folículo en vivo tejido ovárico de Drosophila

Summary

Proporcionamos un protocolo para pH intracelular de un linaje de células epiteliales en el tejido ovárico de Drosophila en la proyección de imagen. Se describen métodos para generar moscas transgénicas expresando un biosensor pH, mCherry::pHluorin, imagen el biosensor usando proyección de imagen de fluorescencia cuantitativa, generar curvas estándar y convertir valores de intensidad de fluorescencia a valores de pH.

Abstract

Cambios en el pH intracelular (pHi) desempeñan papeles importantes en la regulación de muchas funciones celulares, incluyendo metabolismo, proliferación y diferenciación. Por lo general, dinámica de pHi se determina en las células cultivadas, que son susceptibles de medición y la manipulación experimental de pHi. Sin embargo, el reciente desarrollo de nuevas herramientas y metodologías ha permitido estudiar dinámica pHi dentro del tejido intacto, vivo. Para la investigación de Drosophila , un desarrollo importante era la generación de una línea transgénica con un biosensor de pHi, mCherry::pHluorin. Aquí, describimos un protocolo que habitualmente utilizamos para proyección de imagen en ovariolas de Drosophila para medir pHi en el linaje de la célula de vástago (FSC) epitelial del folículo en líneas transgénicas tipo salvaje de mCherry::pHluorin; sin embargo, los métodos aquí descritos pueden ser fácilmente adaptados para otros tejidos, incluyendo los discos de ala y el epitelio del ojo. Se describen técnicas para expresar mCherry::pHluorin en el linaje FSC, manteniendo el tejido ovárico durante la proyección de imagen, vivo y adquirir y analizar imágenes para obtener valores de pHi.

Introduction

Estudios recientes revelaron un papel para cambios en pHi durante celular diferenciación y displasia en vivo^1,2. Estos estudios encontraron que pHi es notablemente consistente en células del mismo tipo en la misma etapa de diferenciación, pero que cambia como las células de transición de una etapa a otra. En algunos casos, bloqueando parcialmente los cambios en pHi altera la diferenciación, lo que sugiere que el cambio en pHi no es sólo una consecuencia de los cambios de destino de la célula pero en cambio ayuda a promover el cambio de destino de la célula, quizás a través de efectos sobre el pH-sensible a la regulación las proteínas o las reacciones químicas necesarias para la diferenciación. Los estudios futuros tienen el potencial para revelar más información sobre las muchas funciones diferentes del pHi dinámica en vivo. Sin embargo, uno de los desafíos de estudiar la pHi durante la diferenciación en vivo es la obtención de medidas precisas de pHi. A diferencia de otras características de diferenciación, tales como cambios en la morfología celular y expresión génica, pHi es una propiedad química lábil de la célula que no se conserva en las células que se han fijado y permeabilized con métodos estándar. Además, pHi puede no ser estable en las células que están estresadas o muere como resultado de la manipulación experimental. Por lo tanto, es importante mantener las células vivas y tan saludable como sea posible cuando mide pHi. Varios colorantes vitales están disponibles que funcionan bien para medir PI de las células en cultura³, pero en muchos casos no son adecuadas para en vivo los estudios porque no penetran el tejido uniformemente o profundamente bastante para proporcionar mediciones precisas .

Para evitar el problema de la penetración de tinte pobre, nosotros y otros hemos utilizado una sonda genéticamente codificada, mCherry::pHluorin^4,5,6,7, que puede ser expresado específicamente en la célula tipos de interés y reflejada en tejido vivo. pHluorin es una variante de la GFP con un pKa superior (~ 7,0 vs ~ 4.0) que dobla más fácilmente a pH más alto; así que la intensidad de fluorescencia total emitida por una población de pHluorin de moléculas en la célula aumenta con el aumento del pHi⁸. Lo importante, la fluorescencia es lineal dentro del rango normal citosólico de los valores de la pHi. En contraste, la fluorescencia de mCherry (pKa ~ 4.5) es insensible a los cambios en el pH dentro de la gama citosólica. Estos dos periodistas son covalente juntos como una sola proteína quimérica, codificada por un marco abierto de lectura único, por lo que siempre están presentes en cantidades iguales. Por lo tanto, el de pHluorin a la intensidad de la fluorescencia mCherry proporciona una medida del pHi que es normalizada a la concentración de la sonda en cada célula. Los cocientes se pueden convertir entonces las estimaciones de los valores de la pHi usando una curva estándar generada por obtener la pHluorin mCherry cocientes de los tejidos que han sido equilibrados a valores de pH conocido.

Aquí, describimos los métodos para el uso de mCherry::pHluorin para medir la pHi del linaje epitelial de la FSC en el ovario del Drosophila . Este tejido bien caracterizado se ha utilizado para modelar diferentes aspectos de la biología epitelial, tales como la célula de vástago auto renovación y diferenciación^9,10,11, migración de la célula colectiva¹² , el desarrollo y mantenimiento de celulares polaridad^13,14. El epitelio del folículo se produce por dos remiten que residen en el borde anterior de los tejidos en una estructura llamada el germarium^15,16. Estas células se dividen regularmente durante la edad adulta para la autorrenovación y producir progenie, denominadas células prefollicle (PFC), que pueden volver a entrar en el nicho y convertirse en un FSC o diferenciar en uno de los tres tipos de células del folículo diferentes: las células polares, las células del tallo, o células del folículo del cuerpo principal. Demostramos previamente que en el tejido de tipo salvaje, el PI aumenta constantemente durante las primeras etapas de diferenciación, de una pHi de aproximadamente 6,8 en remiten a 7.0 en PFC, 7.3 en folículo células². Bloqueo este aumento por la caída de ARNi de un intercambiador sodio/protones ubicuo expresada, DNhe2, severamente deteriora diferenciación de pFC, considerando que el aumento de pHi por la sobreexpresión de DNhe2 causa una leve diferenciación de exceso fenotipo. Estos resultados demuestran que el pHi se mantiene estable en el linaje FSC temprano y que pueden ser experimentalmente aumentado o había disminuido en vivo. Los métodos descritos aquí pueden utilizarse para medir pHi en tejido tipo salvaje o diversas formas de tejidos mutantes, incluyendo caída de ARNi o sobreexpresión usando Gal4 de interés y los clones mitotic.

Protocol

Nota: para medir la pHi en el linaje FSC, calcular la relación de intensidades de fluorescencia de pHluorin a mCherry en Eve, PFC y las células del folículo en condiciones fisiológicas y convertir la relación en valores de pHi con estándar curvas de calibración para cada célula tipo 7. En primer lugar, energizados experimentos de imagen se realizan para medir intensidades de fluorescencia de pHluorin y mCherry en germaria disecado en un tampón que contiene NaHCO 3, que imita …

Representative Results

Aquí hemos descrito el proceso de medición de pHi en el epitelio folicular, que implica varios pasos. En primer lugar, los ovarios son disecados de moscas del genotipo apropiado usando herramientas para disección y montaje (figura 1). Las ovariolas son entonces reflejadas mediante microscopía de fluorescencia cuantitativa y las imágenes se analizan para obtener medidas de pHi. Para cada imagen, se identifican los tipos de células de interés tal como se…

Discussion

Aquí, describimos un método para la medición de PI de las células en el linaje FSC dentro del tejido de tipo salvaje. Este protocolo ha sido desarrollado y refinado durante los últimos cinco años, desde que comenzó a estudiar pHi en Drosophila el tejido ovárico. Durante ese tiempo, el protocolo ha sido utilizado con éxito por varios investigadores en nuestro laboratorio y por lo menos cuatro diferentes spinning disco y microscopios de escaneo láser. La reproducibilidad de nuestra observación original,…

Materials

Fly Stocks
UAS-mCherry::pHluorin[1]
y1 w*;P{GawB}10930/CyO	Bloomington Stock Center	7023
Act-Gal4 flipout stock	Bloomington Stock Center	4409
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals for Buffer preparation
NaCl	Sigma Aldrich	S5886
KCl	Sigma Aldrich	P-3911
glucose	Mallinckrodt	4912
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310
MgSO4	Thermo Fisher Scientific	M63
CaCl2	Sigma Aldrich	C-5080
HCO3	Sigma Aldrich	S-5761
MgCl2	Sigma Aldrich	M-9272
NMDG+	Sigma Aldrich	M-2004
K2HPO4	Mallinckrodt	7088	Use to Make KHPO4 pH 7.4
KH2PO4	Thermo Fisher Scientific	BP362	Use to Make KHPO4 pH 7.4
Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate	Thermo Fisher Scientific	C21421	0.25 mg/ml dilution
Nigericin	Thermo Fisher Scientific	N1495
Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection and mounting tools
2 Dumont Inox forceps (Size 5)	Thermo Fisher Scientific	NC9473431
2 23-gauge syringe needles	Sigma Aldrich	Z192457
9-well glass dissecting dish	Thermo Fisher Scientific	13-748B
Vacuum Grease	Dow Corning	1018817
22 X 40 mM glass coverslips	Thermo Fisher Scientific	12545C
Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness	Ted Pella, Inc.	26023
3-D mounting chamber	custom manufactured		.stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files
Name	Company	Catalog Number	Comments
Other equipment
pH meter	Thermo Fisher Scientific	13-620-183A	Model: Accumet AB15
Dissection microscope	Olympus Corporation	0H11436	Model: SZ2-ST
Confocal Microscope	Leica Biosystems		SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40× objective with a numerical aperture of 1.3