जीन क्लोनिंग के बिना एक जीन-बाधित स्ट्रेप्टोकोकस mutans तनाव की पीढ़ी
Summary
हम जीन-बाधित स्ट्रेप्टोकोकस mutans उपभेदों की पीढ़ी के लिए एक सतही, तेजी से, और अपेक्षाकृत सस्ती विधि का वर्णन; इस तकनीक के जीन की पीढ़ी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है-विभिंन प्रजातियों के उपभेदों बाधित ।
Abstract
एक विशेष जीन के समारोह के elucidation के लिए विशिष्ट तरीकों जंगली प्रकार के तनाव और एक तनाव जिसमें ब्याज की जीन बाधित किया गया है की तुलनात्मक phenotypic विश्लेषण शामिल है । एक जीन व्यवधान डीएनए एक उपयुक्त एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्कर जीन युक्त का निर्माण जीन की पीढ़ी के लिए उपयोगी है बैक्टीरिया में रुकावट उपभेदों । हालांकि, पारंपरिक निर्माण विधियों, जो जीन क्लोनिंग कदम की आवश्यकता होती है, जटिल और समय लेने वाली प्रोटोकॉल शामिल है । यहां, स्ट्रेप्टोकोकस mutans में लक्षित जीन व्यवधान के लिए अपेक्षाकृत सतही, तीव्र, और लागत प्रभावी पद्धति का वर्णन किया गया है । विधि एक 2-कदम फ्यूजन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के विघटन का निर्माण और आनुवंशिक परिवर्तन के लिए electroporation उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल करता है । इस विधि एक एंजाइमी प्रतिक्रिया, पीसीआर के अलावा अंय की आवश्यकता नहीं है, और इसके अतिरिक्त व्यवधान निर्माण के डिजाइन के मामले में अधिक से अधिक लचीलापन प्रदान करता है । electroporation के रोजगार सक्षम कोशिकाओं की तैयारी की सुविधा और परिवर्तन दक्षता में सुधार । वर्तमान विधि जीन की पीढ़ी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है-विभिंन प्रजातियों के उपभेदों बाधित ।
Introduction
जीन समारोह विश्लेषण आमतौर पर एक जंगली प्रकार के तनाव और एक तनाव जिसमें ब्याज की एक विशेष जीन बाधित किया गया है के बीच एक phenotypic तुलना शामिल है । इस जीन विघटन तकनीक taxa की एक विस्तृत श्रृंखला में जीन समारोह विश्लेषण के लिए उपयोग किया गया है, बैक्टीरिया से स्तनधारियों के लिए. एक जीन विघटन निर्माण जीन बाधित तनाव की पीढ़ी के लिए आवश्यक है; इस deoxyribonucleic एसिड (डीएनए) के निर्माण एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्कर के शामिल जीन ऊपर और बहाव लक्ष्य जीन के पार्श्व क्षेत्रों से जुड़े हुए हैं, और मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्यम जीनोम में शामिल है । जीन बाधित तनाव चयनात्मक एंटीबायोटिक युक्त मीडिया का उपयोग कर अलग किया जा सकता है । परंपरागत जीन बाधित तनाव के निर्माण के लिए इस्तेमाल विधि जटिल कदम है, जैसे लक्ष्य जीन के प्रवर्धन के रूप में पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर), एक उपयुक्त प्लाज्मिड में जीन की बंधाव, प्रतिबंध के साथ पाचन की आवश्यकता है एंजाइमों, और रेलीगेशन एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्कर जीन डालने के लिए । इस प्रक्रिया में समय लेने वाली है, कई हफ्तों के लिए कई दिनों ले, हर कदम की सफलता पर निर्भर करता है । इसके अलावा, व्यवधान निर्माण के डिजाइन लक्ष्य जीन की प्रतिबंध एंजाइम साइटों पर निर्भर है । इन मुद्दों को हल करने के लिए, पीसीआर आधारित डीएनए ब्याह तरीकों1,जीन के डिजाइन के लिए2 -बाधित म्यूटेंट के Dictyostelium discoideum3 और Synechocystis sp. PCC68034 बताया गया है । वर्तमान अध्ययन में, एक विधि एक अपेक्षाकृत तेजी से, सतही, और सस्ती तरीके से एक जीन बाधित स्त्रेप्तोकोच्कल तनाव उत्पंन विकसित किया गया था, एक संशोधित पीसीआर आधारित विधि का उपयोग (2-कदम फ्यूजन पीसीआर नामित) व्यवधान के निर्माण के लिए निर्माण और आनुवंशिक परिवर्तन के लिए electroporation ।
2-कदम फ्यूजन पीसीआर जीनोमिक डीएनए की आवश्यकता है, एक पीसीआर टेम्पलेट के रूप में एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्कर जीन, और उचित रूप से डिजाइन oligonucleotide प्राइमरों के चार जोड़े । पहले चरण में (1सेंट पीसीआर), लक्ष्य जीन की एक 1 केबी नदी के ऊपर की दिशा क्षेत्र, लक्ष्य जीन के एक 1 kb बहाव पार्श्व क्षेत्र, और एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्कर जीन पीसीआर द्वारा परिलक्षित होते हैं । दोनों रिवर्स प्राइमर के ‘ 5 क्षेत्रों और आगे प्राइमर, नदी के ऊपर और नीचे की ओर के प्रवर्धन के लिए क्षेत्र पार्श्व, क्रमशः, 15 मार्कर जीन के सिरों के पूरक कुर्सियां शामिल हैं । मार्कर जीन प्रवर्धन के लिए दोनों आगे और रिवर्स प्राइमरों के ‘ 5 क्षेत्रों इसी तरह 15 कुर्सियां लक्ष्य जीन की नदी के ऊपर पार्श्व क्षेत्र के निचले छोर से पूरक और लक्ष्य जीन के नीचे की ओर पार्श्व क्षेत्र के ऊपरी छोर शामिल हैं, क्रमश. इसलिए, तीन प्रवर्धित अंशों में अधिव्याप्त 30-आधार युग्म क्षेत्र फ़्यूज़न साइट पर होते हैं । दूसरे चरण में (2एन डी पीसीआर), पीसीआर तीन टेंपलेट्स के रूप में 1सेंट पीसीआर द्वारा परिलक्षित तीनों टुकड़ों का उपयोग कर नेस्टेड पीसीआर प्राइमरों के साथ किया जाता है । टेंपलेट्स के पूरक क्षेत्र इसके अतिरिक्त 2एनडी पीसीआर के जरिए एक दूसरे से जुड़े हुए हैं । अंत में, मुताबिक़ पुनर्संयोजन के लिए निर्माण electroporation द्वारा जंगली प्रकार के तनाव के लिए शुरू की है । सफल जीन व्यवधान पीसीआर द्वारा सत्यापित किया जा सकता है विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग । हालांकि विघटन निर्माण उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग कर प्रवर्धित है, डीएनए बंधाव या डीएनए पाचन के रूप में अतिरिक्त एंजाइमी प्रतिक्रियाओं, निर्माण उत्पन्न करने के लिए आवश्यक नहीं हैं. इसके अलावा, जीनोम पर एक हटाया या संरक्षित क्षेत्र प्राइमर डिजाइन के अनुसार चुना flexibly हो सकता है ।
वर्तमान काम में, gtfC जीन है, जो स्ट्रेप्टोकोकस mutansमें glucosyltransferase encodes के पूरे कोडिंग क्षेत्र के विलोपन, एक स्त्रेप्तोकोच्कल प्रजातियों में तेजी से, आसान जीन व्यवधान विधि का प्रदर्शन किया गया । साथ ही, एक gtfB-बाधित तनाव एक ही तरीके से उत्पंन किया गया था । glucosyltransferases दोनों gtfC और gtfB द्वारा इनकोडिंग cariogenic दंत फिल्म विकास5,6में योगदान करते हैं । जंगली-प्रकार के तनाव (एस की क्षमता बनाने वाली फिल्म। mutans WT), gtfC-बाधित तनाव (S. mutans ΔgtfC), और gtfB-बाधित तनाव (S. mutans ΔgtfB) का मूल्यांकन किया गया त्यात तुलनात्मक phenotypic िरा. इस प्रोटोकॉल एक अतिरिक्त प्रजातियों के लिए जीन व्यवधान के लिए एक दो कदम विधि के आवेदन प्रदान करता है और taxa की एक व्यापक रेंज में जीन समारोह के अध्ययन के लिए संशोधित किया जा सकता है ।
Protocol
1. प्राइमरी डिजाइन 2-step फ्यूजन पीसीआर और जीन व्यवधान के सत्यापन के लिए प्राइमरों को तैयार करें । नोट: तालिका 1 इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया प्राइमर दृश्यों से पता चलता है. < सबल वर्…
Representative Results
Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल में, 1st पीसीआर के लिए प्राइमरों लगभग 1 केबी नदी के ऊपर और बहाव जीनोम में लक्ष्य क्षेत्र के पार्श्व क्षेत्रों बढ़ाना डिजाइन किया जाना चाहिए । ऐसे लंबे पार्श्व अनुक्रम मुताबिक़ पुन?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के लिए जापान सोसायटी द्वारा विज्ञान के संवर्धन के लिए समर्थन किया गया था [अनुदान संख्या 16K15860 करने के लिए T.M. और 15K15777 करने के लिए राष्ट्रीय].
Materials
| Streptococus mutans | Stock strain in the lab. | Wild-type strain (Strain UA159) | |
| Genomic DNA extraction kit | Zymo Research | D6005 | |
| Bead-beating disruption apparatus | Taitec | GM-01 | |
| Synthetic genes | Eurofins Genomics | Custom-ordered | Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene |
| Thermal cycler | Astec | PC-708 | |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | 35 bases in length |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 | |
| Electroporator | Bio-rad | 1652100 | |
| Electroporation cuvette | Bio-rad | 1652086 | 0.2-cm gap |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture media |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics |
| Erythromycin | Wako | 057-07151 | Antibiotics |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
References
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
- Kuwayama, H., et al. PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors. Nucleic Acids Res. 30 (2), E2 (2002).
- Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II. Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).
- Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis. Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).
- Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).
- LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrob Agents Chemother. 35 (9), 1804-1810 (1991).
- Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis. Gene. 19 (3), 345-353 (1982).
- Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiol Lett. 363 (11), (2016).
- Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infect Immun. 41 (2), 722-727 (1983).
- Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
- Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. J Vis Exp. (69), (2012).
