Поколение ген нарушена Streptococcus mutans штамм без генов клонирования
Summary
Мы описываем легким, быстрым и относительно недорогой метод для генерации ген нарушена Streptococcus mutans штаммов; Эта техника может быть адаптирована для поколения ген нарушена штаммов различных видов.
Abstract
Типичные методы для разяснения функции определенного гена включать сравнительный анализ фенотипических одичал тип деформации и напряжения, в котором было нарушено гена интереса. Конструкцию ДНК гена нарушение, содержащие маркер подходит к антибиотикам ген полезен для поколения ген нарушена штаммов бактерий. Однако обычных строительных методов, которые требуют генов клонирования шаги, включать протоколы сложным и трудоемким. Здесь описан относительно легким, быстрое и эффективное метод срыв целевых генов в Streptococcus mutans . Этот метод использует слияние 2-х ступенчатый полимеразной цепной реакции (ПЦР) для создания разрушение конструкции и электропорации для генетической трансформации. Этот метод не требует ферментативные реакции, за исключением PCR и дополнительно предлагает большую гибкость с точки зрения дизайна разрушение конструкции. Занятость электропорации облегчает подготовку компетентных клеток и улучшает эффективность преобразования. Нынешний метод может быть адаптирована для поколения ген нарушена штаммов различных видов.
Introduction
Анализ функции гена обычно включает фенотипические сравнение между одичал тип деформации и напряжения, в котором было нарушено определенного гена интереса. Этот ген нарушение техника была использована для анализа функции гена в широком диапазоне таксонов, от бактерий до млекопитающих. Ген нарушение конструкция необходима для поколения штамма ген нарушена; Эта конструкция дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) состоит из гена маркер антибиотикорезистентности, сливается в верхнем и нижнем течении, окаймляющие регионов целевого гена и включена в геноме через гомологичная рекомбинация. Джин нарушена деформации могут быть изолированы с помощью селективного носителей, содержащих антибиотик. Обычные метод, используемый для строительства ген нарушена штамм требует сложных шагов, таких как амплификация гена целевой полимеразной цепной реакции (ПЦР), лигирование гена в подходящей плазмиду, пищеварение с ограничением ферменты и religation чтобы вставить маркер антибиотик сопротивление гена. Этот процесс является длительным, принимая несколько дней до нескольких недель, в зависимости от успеха каждого шага. Кроме того дизайн разрушение конструкции зависит энзима ограничения сайтов целевого гена. Для решения этих вопросов, были зарегистрированы на основе ПЦР ДНК сплайсинга методы1,2 для проектирования ген нарушена мутантов сапротрофные discoideum3 и Synechocystis sp. PCC68034 . В настоящем исследовании был разработан метод для создания Джин нарушена стрептококков штамм относительно быстрое, легким и недорогим способом, используя измененный метод на основе ПЦР (обозначено сплавливание 2-шаг ПЦР) для строительства нарушения Конструкция и электропорации для генетической трансформации.
2-шаг-фьюжн, PCR требует геномной ДНК, маркер генов антибиотикорезистентности как шаблон ПЦР и четыре пары надлежащим образом разработаны праймеры олигонуклеотида. На первом шаге (1st ПЦР), 1-КБ вверх по течению фланкируя региона целевого гена, 1-КБ течению фланкируя область целевого гена и Джин антибиотик сопротивление маркер усиливаются методом ПЦР. 5′ регионов обратный грунт и вперед грунтовка для усиления вверх и вниз по течению фланговые регионов, соответственно, включают в себя 15 баз дополняет концы гена маркер. 5′ регионов прямого и обратного Праймеры для амплификации генов маркер аналогичным образом включают 15 баз в дополнение к нижней части вверх по течению фланкируя региона целевого гена и верхний конец области течению фланкируя целевого гена, соответственно. Таким образом три усиливается фрагменты содержат перекрывающиеся области 30-пар на сайте фьюжн. На втором этапе (2nd ПЦР) ПЦР проводится с вложенными праймеры PCR, с использованием трех фрагментов, усиливается 1st PCR как шаблоны. Дополнительно взаимодополняющих регионах шаблоны связаны друг с другом через 2nd ПЦР. Наконец конструкции для гомологичная рекомбинация вводится одичал тип деформации электропорации. Успешное гена нарушения могут быть проверены с помощью конкретных праймеры PCR. Хотя нарушение конструкция усиливается с помощью высокоточных ДНК-полимеразы, дополнительные ферментативных реакций, таких как перешнуровка дна или ДНК пищеварение, не являются необходимыми для создания конструкции. Кроме того удаленные или консервированные региона на геном может гибко выбираться по конструкции праймера.
В настоящей работе удаление всего кодирвоания gtfC ген, который кодирует glucosyltransferase в Streptococcus mutans, была исполнена продемонстрировать метод срыв быстрое, легко гена в стрептококков видов. Кроме того, gtfB-нарушена штамм был создан в том же порядке. Glucosyltransferases, кодируются как gtfC , так и gtfB способствуют кариесогенных Стоматологическая биопленки развития5,6. Биопленки формирование способности одичал тип деформации (S. mutans WT), gtfC-нарушена штамм (S. mutans ΔgtfC) и gtfB-были оценены нарушается штамм (S. mutans ΔgtfB) для сравнительного анализа фенотипические. Этот протокол расширяет применение двухэтапный метод срыв гена для дополнительных видов и могут быть изменены для исследования функции гена в более широкий спектр таксонов.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящем Протоколе Праймеры для 1st ПЦР должны разрабатываться для того чтобы усилить примерно 1 КБ, вверх и вниз по течению фланговых районах целевого региона в геноме. Такие длинные Фланкируя последовательности являются необходимыми для повышения эффективности гомологичная …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддержали японское общество содействия развитию науки [номера грантов 16 K 15860 т.м. и 15 K 15777 N.H.].
Materials
| Streptococus mutans | Stock strain in the lab. | Wild-type strain (Strain UA159) | |
| Genomic DNA extraction kit | Zymo Research | D6005 | |
| Bead-beating disruption apparatus | Taitec | GM-01 | |
| Synthetic genes | Eurofins Genomics | Custom-ordered | Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene |
| Thermal cycler | Astec | PC-708 | |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | 35 bases in length |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 | |
| Electroporator | Bio-rad | 1652100 | |
| Electroporation cuvette | Bio-rad | 1652086 | 0.2-cm gap |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture media |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics |
| Erythromycin | Wako | 057-07151 | Antibiotics |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
References
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
- Kuwayama, H., et al. PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors. Nucleic Acids Res. 30 (2), E2 (2002).
- Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II. Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).
- Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis. Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).
- Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).
- LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrob Agents Chemother. 35 (9), 1804-1810 (1991).
- Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis. Gene. 19 (3), 345-353 (1982).
- Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiol Lett. 363 (11), (2016).
- Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infect Immun. 41 (2), 722-727 (1983).
- Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
- Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. J Vis Exp. (69), (2012).
