Nova aplicação de um jato de Plasma a pressão atmosférica como agente Neuro-protetor contra a lesão induzida por privação de glicose das células SH-SY5Y

Summary

Um protocolo para o aplicativo neuroprotetor da pressão atmosférica de baixa dose de tratamento de plasma em lesões de SH-SY5Y de induzida por privação de glicose.

Abstract

Jato de plasma a pressão atmosférica (APPJ) tem atraído a atenção de muitos pesquisadores de várias disciplinas nos últimos anos, porque suas emissões incluem vários tipos de espécies reativas de nitrogênio (RNS) e espécies reativas de oxigênio (ROS). Nosso estudo anterior demonstrou o efeito de tilacoides da APPJ contra lesões induzida por estresse oxidativos. O objetivo do presente estudo é fornecer um protocolo de tratamento detalhado em vitro sobre os aplicativos neuroprotetor de hélio APPJs na lesão induzida por privação de glicose nas células SH-SY5Y. A linha de células humanas de neuroblastoma-derivado de SH-SY5Y foi mantida em meio RPMI 1640, suplementado com soro fetal bezerro de 15%. O meio de cultura foi então alterado para RPMI 1640 sem glicose antes do tratamento APPJ. Após uma incubação de 1 h em uma incubadora de célula, viabilidade celular foi determinada utilizando célula contando Kit 8. Os resultados mostraram que, comparado com o grupo de privação de glicose, as células tratadas com APPJ exibiram viabilidade celular significativamente aumentada de forma dose-dependente, com 8 s/bem observado como uma dose ideal. Enquanto isso, o fluxo de hélio não teve efeito sobre a imparidade de celular induzida por privação de glicose. Nossos resultados indicaram que a APPJ poderia potencialmente ser usado como um método de tratamento para as doenças no sistema nervoso central relacionadas com privação de glicose. Este protocolo também pode ser usado como uma aplicação de tilacoides para outras células com diferentes deficiências, mas a cultura de pilha e condições de tratamento APPJ devem ser reajustadas, e a dose de tratamento deve ser relativamente baixa.

Introduction

O cérebro adulto utiliza quase exclusivamente glicose como um substrato para o metabolismo energético sob condições fisiológicas normais. O cérebro humano constitui apenas 2% do peso corporal, mas consome aproximadamente 25% da glicose total dentro do corpo¹. Está bem documentado que disfunção do metabolismo de glicose é uma das principais alterações patológicas durante o acidente vascular cerebral isquêmico e várias doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer (AD), a doença de Huntington (HD) e a doença de Parkinson (PD) ^2,3. A falta de glicose e a absorção de glicose prejudicada ou fosforilação oxidativa pode afetar diretamente a produção de ATP e ainda induzir a morte de células nervosas, o que pode aumentar o risco de disfunção neuronal, sugerindo que manter viabilidade celular ou atrasando o ferimento da pilha após privação de glicose pode ser uma abordagem razoável para o tratamento destas doenças. A investigação dos efeitos neuroprotective através da modulação de glicose, com foco em agentes anti-inflamatórios, moduladores de canais de íon, catadores de radicais livres, fatores neurotróficos, etc tem sido de interesse. No entanto, a tradução dessas abordagens neuroprotetor do banco para a prática clínica não foi sucesso⁴.

Jatos de plasma a pressão atmosférica (APPJs) são um novo tipo de tecnologia de descarga de gás atmosférico de baixa temperatura que tem atraído a atenção de muitos pesquisadores de várias disciplinas nos últimos anos. APPJs foram usados por décadas em várias aplicações biomédicas, tais como o tratamento do câncer célula inativação bacteriana, coagulação sanguínea, cicatrização de feridas, medicina oral,^5, etc.⁶, devido as emissões de vários tipos de espécies reativas de nitrogênio (RNS) e espécies reativas de oxigênio (ROS) (Figura 1)⁷. Aplicações anteriores de bio-medicina de plasma concentrou-se principalmente o stress oxidativo e/ou nitrative em bactérias, células e tecidos⁸. No entanto, a APPJ também poderia ser uma “espada de dois gumes” desde RNS e ROS são moléculas de sinalização intracelulares importantes relacionadas a muitos processos fisiológicos e fisiopatológicos⁹. Óxido nitroso (n) controla uma grande variedade de processos biológicos e desempenha um duplo papel no corpo humano, especialmente no sistema nervoso central (SNC). Baixos níveis de n mostraram suas atividades neuroprotetor ambos em vitro e em vivo através de múltiplos caminhos de sinal¹⁰. Nosso estudo anterior relatada pela primeira vez o hélio produção não estava envolvida no efeito neuroprotetor da APPJ contra lesões induzida por estresse oxidativo¹¹APPJ-induzida. No entanto, os efeitos da APPJs sobre outras lesões não foram relatados. Portanto, o objetivo do presente estudo é fornecer um protocolo de tratamento em vitro sobre os aplicativos neuroprotetor de hélio APPJ na lesão induzida por privação de glicose nas células SH-SY5Y. Diferente de estudos anteriores, nosso protocolo usado tratamento de plasma de baixa dose para aplicações neuroprotetor sem consequências de lesões excessivas induzida por plasma, indicando que o tratamento APPJ poderia ser potencialmente usado como um romance “nenhuma droga do doador “para futuras pesquisas e até mesmo para a tradução clínica. Este protocolo foi também sugerido para ser usado como um aplicativo de tilacoides para outros tipos de células com diferentes deficiências, mas as condições de tratamento APPJ devem ser reajustadas e a dose de tratamento deve ser relativamente baixa.

Protocol

1. preparação do dispositivo APPJ atenção: favor consultar todas as fichas de dados de segurança (MSDS) antes do uso. Por favor, use as práticas de segurança adequadas ao executar todos os experimentos, incluindo o uso de uma coifa e equipamento de protecção pessoal (óculos de segurança, luvas de proteção, jaleco, etc.). O protocolo exige célula padrão manipulação técnicas (esterilização, recuperação da célula, célula passagem, congelamento de célula, coloraca…

Representative Results

Dados são expressos como a média ± DP pelo menos três experimentos independentes. Os resultados do grupo foram analisados para variância usando ANOVA. Todas as análises foram realizadas utilizando o software de análise estatística de prisma e p < 0.05 foi o limiar de significância estatística. Viabilidade celular foi mensurada após 4 h de incubação CCK-8. Como mostrado na Figura 3, privação de glicose reduzidos a viabilidade das células SH-SY5Y…

Discussion

SH-SY5Y células são uma linhagem de células de neuroblastoma-derivado humano e são amplamente utilizadas como um modelo de célula apropriada para estudos em vitro na neurotoxicidade ou neuroproteção¹². A linha de celular de SH-SY5Y foi sensível às condições de privação de glicose. Viabilidade celular diminuiu para quase 50% após a privação de glicose 1 h, que é a condição de viabilidade celular ideal para estudos de farmacodinâmica. Além disso, a CCK-8 reagente não t…

Materials

SH-SY5Y cell line	China Center for Type Culture Collection	3111C0001CCC000026
RPMI 1640 medium	Thermo Scientific	21875091	stored at 4 °C
RPMI 1640 medium no glucose	Thermo Scientific	11879020	stored at 4 °C
fetal calf serum	Thermo Scientific	16000044	stored at -20 °C
tripsin-EDTA solution	Solarbio	T1300	stored at 4 °C
96 wells plate	corning	3599
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)	Dojindo Laboratories	CK04	stored at 4 °C
microplate reader	Tecan	M200 Pro	for measuring the absorbance at 450 nm
High – voltage Power Amplifier	Trek	PD06087	for amplifing the power
Function Signal Generator	MaZe Electronics Science&Technology	AT30120	for providing the specific signal
High – Voltage Probe	Tektronix	P6015A	for detecting high voltage
Digital Oscilloscope	Tektronix	DPO4104B	for displaying the signal