הזרקת hydrodynamic אגן הכליה נגיפי ביטוי של חלבונים בתוך הכליה.
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה להחדיר פלסמיד DNA לתוך הכליה העכבר באמצעות אגן הכליה כדי לייצר transgene ביטוי במיוחד בתוך הכליה.
Abstract
הזרקת hydrodynamic יוצר סביבה מקומיים, בלחץ גבוה כדי transfect רקמות שונות עם דנ א פלסמיד וחומרים אחרים. הזרקת וריד הזנב hydrodynamic, לדוגמה, היא שיטה ומבוססת שבאמצעותו יכול להיות transfected הכבד. כתב יד זה מתאר יישום של עקרונות hydrodynamic על ידי הזרקה של הכליה העכבר ישירות עם פלסמיד הדנ א על ביטוי גנים ספציפיים כליות. עכברים הם מרדימים, הכליה נחשף על ידי חתך האגף ולאחריה זריקה מהירה של פלסמיד פתרון ה-DNA המכיל ישירות לתוך אגן הכליה. המחט הוא שמר על המקום לעשר שניות, מקום החתך מאוחה. למחרת, לחיות הדמיה בעלי חיים, תספיג או אימונוהיסטוכימיה עשוי לשמש assay ביטוי גנים או אחרים מבחני מתאים את transgene של בחירה משמשים לגילוי של החלבון עניין. שיטות שפורסמו להאריך ביטוי גנים כוללים אינטגרציה transgene בתיווך transposon וטיפול ציקלופוספמיד כדי לעכב את התגובה החיסונית כדי transgene.
Introduction
טכניקת ההזרקה של וריד הזנב hydrodynamic הפך נפוץ דרך כדי להשיג רמות גבוהות של ביטוי גנים העכבר הכבד1,2. הכליות הן גם transfected באמצעות הטכניקה הזו ברמה יותר נמוכה, כ 100-fold פחות3. הזרקת hydrodynamic אגן הכליה המתוארים כאן מספק דרך פשוטה כדי לשלוט יחודיות של איברים ביטוי באמצעים פיזיים, באמצעות אותם עקרונות hydrodynamic שהוקמו בעבר כבד4,5 , שרירים6ו-7,8אחרים איברים. שיטה זו transfects תאים בעלי חיים ויוו באמצעות לחץ ותוקנו מהירות כדי לאלץ את ה-DNA המכיל נוזל לתוך התאים, בו זמנית גרימת נזק לאיבר זה במהירות9. באמצעות טכניקות ניתוחיות ומבוססת להמחיש את הכליה דרך החתך האגף10 יחד עם זריקה אחת על ידי מזרק אינסולין, מצאנו תקנים מוצלחת של סוגים שונים של תאי הכליה, בעיקר interstitial fibroblasts, בקוריאנית, צינור איסוף11. דיסקציה של עכברים אלה הראו כי איברים אחרים הם לא transfected ברמה גבוהה מספיק כדי להמחיש מאת לוציפראז הדמיה טכניקות11. מאז הטכניקה היא נגיפי, השימוש פלסמיד DNA עבור תרביות תאים מאפשרת הכנה קלה ומהירה של ריאגנטים הנדרש להזרקה.
השתמשנו זריקות hydrodynamic מקומי להביע גלוטתיון נוגד חמצון S-טרנספראז A4 הקולטן 1 פקטורי גדילה דמויי אינסולין, את אריתרופויאטין ההורמון בכליה, כולם בעלי השפעות ביולוגיות הצפוי11, 12 , 13. הערכה מפורטת של התוואי של המינהל, נפח הזרקה, מינון ה-DNA, יזם הבחירה היה שבוצעו11. בנוסף, שתי piggyBac transposon מערכת ו/או ציקלופוספמיד הטיפול לדכא את התגובה החיסונית transgene כבר הראו לשפר לטווח ארוך ג’ין ביטוי תוצאות11. חוקרים אחרים יש להשתמש בגישה וריד הכליה לעכבר עם הצלחה, השגת יעילות גבוהה תקנים עבור פרקי זמן של יותר מ חודש14. עם זאת, תיקון גנטי של פנוטיפים מחקה מחלות אנושיות בדרך כלל מבוצעות בעכברים לראשונה כמושג הוכחה-של-מאחר ביותר בתרבית של דגמים גנטיים הם מודלים העכבר. אנו לעומת הזרקה וריד הכליה אל אגן הכליה הזרקה, נמצא כי הזרקה לתוך האגן הכליה סופריור לוריד הכליה על ביטוי גנים (כ כוחנו גבוה) והישרדות11. אגן הכליה הוא מסלול אידיאלי של הערך לתוך הכליה כי זה גמיש מספיק לסבול תנודות ייצור השתן, והוא לעיתים קרובות מסוגל לשמור המבנית שלו גם כאשר התרחבו במהלך hydronephrosis. בנוסף, הזרקה לתוך האגן הכליה איפשרה גישה הכליה ללא פירסינג הקפסולה כליות, המאפשר את הנוזלים מוזרק בעליל יישמרו על ידי הכליות טוב יותר intraparenchymal הזרקת. איברים אחרים העכבר אין מסלול של ערך אחר מאשר להערכת, אבל המרחב השתן של הכליה הוא אתר אידיאלי הזרקה. בנוסף, זריקה לווריד כליות כתוצאה דליפה של דם לתוך חלל הבטן. עוצמת כליות מוחלטת פראי-סוג העכבר הכליות הוערך על ידי תהודה מגנטית יהיה כ 0.2 ס מ3, אז הנפח של כליה אחת שווה בקירוב כמות הנוזלים מוזרק על ידי רופא אגן הכליה hydrodynamic הזרקה (100 µL)15. במסמך זה, עשינו זמין לכל הניואנסים מפורט של פרוטוקול הזרקת hydrodynamic אגן הכליה להשגת תקנים לשחזור של הכליה.
Protocol
Representative Results
Discussion
ב פרוטוקול זה מתוארת שיטה חזקה להשגת ביטוי גנים לשחזור באופן ספציפי בתוך הכליה. בידי מנתח מנוסה בינוני מצאנו האחוז של עכברים transfected באמצעות הטכניקה הזו להיות בטווח של 50-100%, בהתאם לגיל העכבר ואת הרגישות של המדידה של transgene. הרמה של ביטוי גנים לוציפראז היה מעל רקע במשך מספר חודשים בעכברים שקיב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרס פיתוח הקריירה של המחלקה ותיקי לענייני [BX002797] תמך L.E.W. מכוני הבריאות הלאומיים [R01-DK095867] ונתמך American Heart Association [15GRNT25700209] ג’יי מכוני הבריאות הלאומיים [DK093660], המחלקה לענייני חיילים משוחררים [BX002190] ואנדרבילט לחקר מחלת כליות תמיכה, M.H.W. חומר זה הוא התוצאה של עבודה נתמכת עם משאבים ושימוש במתקני במערכת הבריאות VA עמק טנסי.
Materials
| AnaSed Xylazine | Patterson Veterinary | 07-808-1947 | Anesthetic – Not controlled substance |
| BD Insulin Syringe 0.5 mL 29G 1/2 Inch | Cardinal Health | 309306 | Required syringes |
| Buprenex | Pharmacist/Veterinarian | Analgesia – Controlled Substance | |
| Dynarex Disposable Towel Drape | Thermo Fisher Scientific | 19-310-671 | Place over heat pad |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Use only endotoxin-free plasmid DNA |
| Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Positive Control | Charles River | PC200 | Positive control for endotoxin test |
| Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Single Test Vial | Charles River | R13500 | Endotoxin test |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5882 | Surgical tool |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouch – 9" | Thermo Fisher Scientific | 01-812-51 | For autoclaving surgical tools |
| Gaymar Heat Pump | Paragon Medical | TP-700 | Water-circulating heat pump |
| Germinator 500 | Roboz Surgical Instrument | DS-401 | To reuse surgical tools during surgery |
| Graefe Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5136 | Surgical tool |
| Graefe Tissue Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5153 | Surgical tool |
| Halsey Needle Holder, 5" Length | Roboz Surgical Instrument | RS-7841 | Surgical tool |
| Heat pads – 15" x 21" – need at least 3 | Paragon Medical | TP22G | For use with Gaymar Heat Pump |
| IsoFlo (Isoflurane, USP) | Abbott Animal Health | 5260-04-05 | For imaging and euthanasia |
| Isotec Isoflurane Delivery System Vaporizor | Smiths Medical | VCT3K2 | For imaging and euthanasia |
| Ketamine | Pharmacist/Veterinarian | Anesthetic – Controlled Substance | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Laboratory tissues |
| Living Image software | Caliper Life Sciences | For live animal imaging | |
| Luciferin | Perkin Elmer | 122796 | For live animal imaging |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000-US-CAN | Spectrophotometer for DNA measurement |
| Prevantics Swabs | Thermo Fisher Scientific | 23-100-110 | For skin surgery prep |
| Prolene 5-0 sutures Taper 30" | Thermo Fisher Scientific | NC0256891 | Non-absorbable sutures for skin |
| Puralube Brand Opthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | To keep eyes moist during surgery |
| Trans IT – QR Hydrodynamic Delivery Solution | Mirus Bio | MIR-5240 | Hydrodynamic delivery buffer for diluting DNA |
| Vicryl 5-0 Sutures J303H | Thermo Fisher Scientific | NC9816710 | Absorbable sutures for muscle layer |
| Wahl Mini Arco Clipper | Med-Vet International | 8787-1550 | Shaver for skin prep |
| Xenogen IVIS 200 | Caliper Life Sciences | For live animal imaging |
References
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Human Gene Therapy. 10, 1735-1737 (1999).
- Fumoto, S., Nishimura, K., Nishida, K., Kawakami, S. Three-Dimensional Imaging of the Intracellular Fate of Plasmid DNA and Transgene Expression: ZsGreen1 and Tissue Clearing Method CUBIC Are an Optimal Combination for Multicolor Deep Imaging in Murine Tissues. PLoS One. 11 (1), e0148233 (2016).
- Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume. Gene Ther. 13 (24), 1696-1702 (2006).
- Kamimura, K., Suda, T., Xu, W., Zhang, G., Liu, D. Image-guided, lobe-specific hydrodynamic gene delivery to swine liver. Mol Ther. 17 (3), 491-499 (2009).
- Kamimura, K., Zhang, G., Liu, D. Image-guided,intravascular hydrodynamic gene delivery to skeletal muscle in pigs. Mol Ther. 18 (1), 93-100 (2010).
- Suda, T., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications. Mol.Ther. 15 (12), 2063-2069 (2007).
- Alino, S. F., et al. Naked DNA delivery to whole pig cardiac tissue by coronary sinus retrograde injection employing non-invasive catheterization. J Gene Med. 12 (11), 920-926 (2010).
- Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver. Gene Ther. 14 (2), 129-137 (2007).
- Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice. J Vis Exp. (78), (2013).
- Woodard, L. E., et al. Kidney-specific transposon-mediated gene transfer in vivo. Sci Rep. 7, 44904 (2017).
- Liang, A., et al. Loss of glutathione S-transferase A4 accelerates obstruction-induced tubule damage and renal fibrosis. Journal of Pathology. 228 (4), 448-458 (2012).
- Liang, M., et al. Protective role of insulin-like growth factor-1 receptor in endothelial cells against unilateral ureteral obstruction-induced renal fibrosis. Am J Pathol. 185 (5), 1234-1250 (2015).
- Corridon, P. R., et al. A method to facilitate and monitor expression of exogenous genes in the rat kidney using plasmid and viral vectors. Am J Physiol Renal Physiol. 304 (9), F1217-F1229 (2013).
- Wallace, D. P., et al. Tracking kidney volume in mice with polycystic kidney disease by magnetic resonance imaging. Kidney Int. 73 (6), 778-781 (2008).
- Woodard, L. E., Wilson, M. H. piggyBac-ing models and new therapeutic strategies. Trends Biotechnol. 33 (9), 525-533 (2015).
- Yeikilis, R., et al. Hydrodynamics based transfection in normal and fibrotic rats. World J Gastroenterol. 12 (38), 6149-6155 (2006).
- Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. J Vis Exp. (41), (2010).
- Wooddell, C. I., et al. Muscle damage after delivery of naked plasmid DNA into skeletal muscles is batch dependent. Hum Gene Ther. 22 (2), 225-235 (2011).
- Crespo, A., et al. Hydrodynamic liver gene transfer mechanism involves transient sinusoidal blood stasis and massive hepatocyte endocytic vesicles. Gene Ther. 12 (11), 927-935 (2005).
- Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study. Gene Ther. 21 (6), 618-628 (2014).
