JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Одноместный молекула манипуляции G-quadruplexes, Магнитные пинцеты

Published: September 19, 2017
doi:
10.3791/56328
, , , ,
1School of Pharmacy, Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology, 2Mechanobiology Institute,National University of Singapore, 3Department of Physics,National University of Singapore, 4Research Institute for Biomimetics and Soft Matter, Fujian Provincial Key Lab for Soft Functional Materials Research, Department of Physics,Xiamen University, 5Center for Bioimaging Sciences,National University of Singapore

Summary

Одной молекулы Магнитные пинцеты платформу для манипулирования G-quadruplexes сообщается, что позволяет для изучения G4 стабильность и регулирование различных белков.

Abstract

Non канонические нуклеиновой кислоты вторичная структура, которую G-quadruplexes (G4) участвуют в различных клеточных процессах, таких как репликация ДНК, транскрипция, обработки РНК и удлинение теломер. В ходе этих процессов различные белки связывают и разрешить G4 структуры для выполнения их функций. Как функция G4 часто зависит от стабильности ее складчатые структуры, важно исследовать, как белки, связывающие G4 регулировать стабильности G4. Эта работа представляет метод для обработки одной молекулы G4, используя Магнитные пинцеты, который позволяет исследования регулирования G4 связывания белков на одной молекулы G4 в режиме реального времени. В общем этот метод подходит для широкий спектр применений в исследованиях для взаимодействия белков/лигандов и правил на различных вторичных структур ДНК или РНК.

Introduction

Четыре мель ДНК или РНК G4 структуры играют решающую роль в многих важных биологических процессов1. Многие белки участвуют в привязке G4 и регулирования, включая белки, связывающие теломер (теломеразы, РПА, TEBPs, Аппл1, TRF2)1,2, факторы транскрипции (nucleolin, PARP1)3, РНК, белков (hnRNP А1, обработки hnRNP A2)4, Хеликазы (BLM, FANCJ, RHAU, предупреждение, Dna2, Pif1)5и репликацию ДНК, связанных белков (Rif1, Rev. 1, PrimPolymerase)6. Связывание с белками может стабилизировать или дестабилизировать G4 структур; Таким образом, регулирующих последующие биологические функции. Стабильность G4 измерялась тепловой плавка с использованием ультрафиолетового (УФ) или круговой дихроизма (CD) методы7. Однако, такие условия не являются физиологические соответствующих и трудно применять к изучению воздействия связывания белков7.

Бурное развитие в одной молекулы манипуляции технологий позволило исследования складывания и раскладывания биомолекулы, такие как ДНК или белка, на уровне одной молекулы с резолюцией нанометров в реальном времени8. Атомно-силовой микроскопии (АСМ), Оптический пинцет и Магнитные пинцеты являются наиболее часто используемые методы манипуляции одной молекулы. По сравнению с AFM и Оптический пинцет9, Магнитные пинцеты позволяют стабильные измерения складные разворачивается динамики одной молекулы дней, используя технику анти дрейф10,11.

Здесь один молекула манипуляции платформы, используя магнитные Пинцеты для изучения регуляции G4 стабильности путем связывания белков-сообщил12,13. Этой работе излагаются основные подходы, включая подготовку образца и потока канала, установки Магнитные пинцеты и калибровки силы. Управления сил и против дрейфа протоколов, как описано в шаге 3 позволяют на долгое время измерения при различных сил элементы управления, например постоянная сила (силы зажима) и постоянной загрузки оценить (сил рампы) и сила прыжок измерения. Протокол калибровки силы, описанные в шаге 4 позволяет калибровки силы < 1 мкм короткие тросов над большой силой диапазон до 100 pN, с относительной погрешностью в пределах 10%. Пример регулирования устойчивости Helicase РНК, связанные с AU-богатые элемент (RHAU) helicase (псевдоним DHX36, G4R1), который играет существенную роль в урегулировании что РНК G4 используется для демонстрации применения этой платформы13.

Protocol

1. Подготовка G4 ДНК для одной молекулы растяжение подготовить 5 '-тиоловых помечены и 5 '-биотин, помечены dsDNA ручки методом ПЦР с помощью DDNA полимеразы на шаблоне ДНК фага лямбда, используя 5 '-тиоловых и 5 '-биотин Праймеры 14 ( рис. 1). Обе ручки dsDNA им…

Representative Results

Настройки эксперимента для растяжения одной молекулы G4 показан на рисунке 4. Последовательность формирования G4 одноцепочечной интервале между двумя ручками dsDNA был привязанный между coverslip и парамагнитными шарик. Чтобы найти шарик привязанный единый ds…

Discussion

Как описано выше, платформу для изучения механическая стабильность G4 ДНК и взаимодействий протеина G4 с помощью одной молекулы Магнитные пинцеты сообщается. Сопроводительных платформа, разработаны высокоэффективные протоколы нахождения G4 ДНК троса и измерение динамики складной разв?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят Meng Pan за корректуру рукопись. Эта работа поддерживается, Сингапур министерства от образования академических исследований Фонд Tier 3 (MOE2012-T3-1-001) до Д.Ю; Национальный исследовательский фонд через Сингапур Mechanobiology института для Д.Ю; Национальный исследовательский фонд, офис премьер-министра, Сингапур, в рамках своей программы Investigatorship СР (СР № Investigatorship премии СР-NRFI2016-03 для Д.Ю; Фонд фундаментальных исследований университетов Центральной H. Y (2017KFYXJJ153).

Materials

DNA PCR primers IDT DNA preparations
DNA PCR chemicals NEB DNA preparations
restriction enzyme BstXI NEB R0113S DNA preparations
coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) BMH.BIOMEDIA 72204 flow channel preparation
Decon90 Decon Laboratories Limited flow channel preparation
APTES Sigma 440140-500ML flow channel preparation
Sulfo-SMCC ThermoFisher Scientific 22322 flow channel preparation
M-280, paramganetic beads,streptavidin ThermoFisher Scientific 11205D flow channel preparation
Polybead Amino Microspheres 3.00 μm Polysciences, Inc 17145-5 flow channel preparation
2-Mercaptoethanol Sigma M6250-250ML flow channel preparation
Olympus Microscopes IX71 Olympus IX71 Magnetic tweezers setup
Piezo-Z Stages P-721 Physik Instrumente P-721 Magnetic tweezers setup
Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X Olympus MPLAPON-Oil 100X Magnetic tweezers setup
CCD/CMOS camera AVT Pike F-032B Magnetic tweezers setup
Translation linear stage Physik Instrumente MoCo DC Magnetic tweezers setup
LED Thorlabs MCWHL Magnetic tweezers setup
Cubic Magnets Supermagnete Magnetic tweezers setup
Labview National Instruments Magnetic tweezers setup
OriginPro/Matlab OriginLab/MathWorks Data analysis
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rhodes, D., Lipps, H. J. G-quadruplexes and their regulatory roles in biology. Nucleic Acids Res. 43 (18), 8627-8637 (2015).
  2. Brazda, V., Haronikova, L., Liao, J. C., Fojta, M. DNA and RNA quadruplex-binding proteins. Int J Mol Sci. 15 (10), 17493-17517 (2014).
  3. Gonzalez, V., Hurley, L. H. The C-terminus of nucleolin promotes the formation of the c-MYC G-quadruplex and inhibits c-MYC promoter activity. Biochemistry. 49 (45), 9706-9714 (2010).
  4. Wang, F., et al. telomerase-interacting protein that unfolds telomere G-quadruplex and promotes telomere extension in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), 20413-20418 (2012).
  5. Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).
  6. Schiavone, D., et al. PrimPol Is Required for Replicative Tolerance of G Quadruplexes in Vertebrate Cells. Mol Cell. 61 (1), 161-169 (2016).
  7. Lane, A. N., Chaires, J. B., Gray, R. D., Trent, J. O. Stability and kinetics of G-quadruplex structures. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5482-5515 (2008).
  8. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy. Annu Rev Biophys. 43, 19-39 (2014).
  9. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  10. Chen, H., et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA. Biophys J. 100 (2), 517-523 (2011).
  11. Chen, H., et al. Dynamics of equilibrium folding and unfolding transitions of titin immunoglobulin domain under constant forces. J Am Chem Soc. 137 (10), 3540-3546 (2015).
  12. You, H., Wu, J., Shao, F., Yan, J. Stability and kinetics of c-MYC promoter G-quadruplexes studied by single-molecule manipulation. J Am Chem Soc. 137 (7), 2424-2427 (2015).
  13. You, H., Lattmann, S., Rhodes, D., Yan, J. RHAU helicase stabilizes G4 in its nucleotide-free state and destabilizes G4 upon ATP hydrolysis. Nucleic Acids Res. 45 (1), 206-214 (2017).
  14. You, H., et al. Dynamics and stability of polymorphic human telomeric G-quadruplex under tension. Nucleic Acids Res. 42 (13), 8789-8795 (2014).
  15. Fu, H., Chen, H., Marko, J. F., Yan, J. Two distinct overstretched DNA states. Nucleic Acids Res. 38 (16), 5594-5600 (2010).
  16. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82 (6), 3314-3329 (2002).
  17. Fu, H., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
  18. Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
  19. Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
  20. Chen, H., et al. Improved High-Force Magnetic Tweezers for Stretching and Refolding of Proteins and Short DNA. Biophys. J. 100 (2), 517-523 (2011).
  21. Fu, H. X., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
  22. Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
  23. Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
  24. Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
  25. Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
  26. De Vlaminck, I., Dekker, C. Recent advances in magnetic tweezers. Annu Rev Biophys. 41, 453-472 (2012).
  27. Yan, J., Skoko, D., Marko, J. F. Near-field-magnetic-tweezer manipulation of single DNA molecules. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 70 (1 Pt 1), 011905 (2004).
  28. Le, S., et al. Disturbance-free rapid solution exchange for magnetic tweezers single-molecule studies. Nucleic Acids Res. 43 (17), e113 (2015).
  29. Neidle, S. Quadruplex Nucleic Acids as Novel Therapeutic Targets. J Med Chem. 59 (13), 5987-6011 (2016).
  30. Simone, R., Fratta, P., Neidle, S., Parkinson, G. N., Isaacs, A. M. G-quadruplexes: Emerging roles in neurodegenerative diseases and the non-coding transcriptome. FEBS Lett. 589 (14), 1653-1668 (2015).
  31. Balasubramanian, S., Hurley, L. H., Neidle, S. Targeting G-quadruplexes in gene promoters: a novel anticancer strategy?. Nat Rev Drug Discov. 10 (4), 261-275 (2011).
  32. Amato, J., et al. Toward the Development of Specific G-Quadruplex Binders: Synthesis, Biophysical, and Biological Studies of New Hydrazone Derivatives. J Med Chem. 59 (12), 5706-5720 (2016).
  33. Wells, R. D. Non-B DNA conformations, mutagenesis and disease. Trends Biochem Sci. 32 (6), 271-278 (2007).

Tags

G-quadruplexMagnetic TweezersSingle-molecule ManipulationFolding And UnfoldingBinding ProteinsDNA-protein InteractionsHelicase ActivityDNA Tether FormationParamagnetic BeadsNanometer-scale Dynamics

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. J. Vis. Exp. (127), e56328, doi:10.3791/56328 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image