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Biochemistry

Manipulación de una sola molécula de G-quadruplexes por pinzas magnéticas

Published: September 19, 2017
doi:
10.3791/56328
, , , ,
1School of Pharmacy, Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology, 2Mechanobiology Institute,National University of Singapore, 3Department of Physics,National University of Singapore, 4Research Institute for Biomimetics and Soft Matter, Fujian Provincial Key Lab for Soft Functional Materials Research, Department of Physics,Xiamen University, 5Center for Bioimaging Sciences,National University of Singapore

Summary

Una plataforma de una sola molécula magnética Pinzas para manipular G-quadruplexes se divulga, que permite el estudio de estabilidad de G4 y regulación por diversas proteínas.

Abstract

Estructura secundaria de ácidos nucleicos no canónicos que g-quadruplexes (G4) intervienen en diversos procesos celulares, tales como la replicación del ADN, transcripción, procesamiento de RNA y alargamiento de los telómeros. Durante estos procesos, varias proteínas se unen y resolución estructuras G4 para realizar su función. Como la función de G4 a menudo depende de la estabilidad de su estructura doblada, es importante investigar cómo G4 proteínas regulan la estabilidad del G4. Este trabajo presenta un método para manipular las moléculas individuales de G4 con pinzas magnéticas, que permite estudios de la regulación de proteínas G4 en una sola molécula G4 en tiempo real. En general, este método es conveniente para una amplia gama de aplicaciones en estudios de interacciones de proteínas/ligandos y las regulaciones sobre varias estructuras secundarias DNA o RNA.

Introduction

Trenzado de cuatro estructuras de ADN o ARN G4 desempeñan un papel crítico en muchos procesos biológicos importantes1. Muchas proteínas están implicadas en el enlace de G4 y regulación, incluyendo proteínas telomere (telomerasa, TRF2, POT1, RPA, TEBPs)1,2, factores de transcripción (nucleolin PARP1)3, RNA, proteínas (hnRNP A1, de procesamiento hnRNP A2)4, helicasas (BLM FANCJ RHAU, WRN, Dna2, Pif1)5y replicación del ADN relacionadas con proteínas (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. Unión a proteínas puede estabilizar o desestabilizar las estructuras G4; así regular las funciones biológicas posteriores. La estabilidad del G4 se midió por termo fusión usando radiación ultravioleta (UV) o métodos de dicroísmo circular (CD)7. Sin embargo, tales condiciones no son fisiológicos relevantes y son difíciles de aplicar al estudio de los efectos de la Unión de proteínas7.

El rápido desarrollo de tecnologías de manipulación de una sola molécula ha permitido estudios de plegar y desplegar de una biomolécula, como ADN o una proteína, a nivel de una sola molécula con resolución nanométrica en tiempo real8. Microscopía de fuerza atómica (AFM), pinzas ópticas y pinzas magnéticas son los más utilizados métodos de manipulación de una sola molécula. En comparación con AFM y pinza óptica9, pinzas magnéticas permiten mediciones estables de plegar-desplegar dinámicas de una sola molécula durante días utilizando una técnica anti deriva10,11.

Aquí, una plataforma de manipulación de una sola molécula con pinzas magnéticas para estudiar la regulación de la estabilidad de la G4 de las proteínas es divulgado12,13. Este trabajo describe los métodos básicos, incluyendo preparación de muestra y el flujo de canal, la instalación de pinzas magnéticas y la calibración de fuerza. Permiten el control de la fuerza y los protocolos anti deriva como se describe en el paso 3 para largo tiempo las mediciones con varios controles de la fuerza, como fuerza constante (fuerza de sujeción) y constante carga tarifa (fuerza-rampa) y medición de salto de fuerza. El protocolo de calibración de fuerza se describe en el paso 4 permite calibración de fuerza de < correas cortas 1 μm sobre una fuerza amplia gama pN hasta 100, con un error relativo dentro del 10%. Un ejemplo de regulación de la estabilidad de la helicasa de ARN asociada a helicase de elemento (RHAU) ricos en AU (alias DHX36, G4R1) que juega un papel esencial en la solución de que RNA G4 se utiliza para demostrar las aplicaciones de esta plataforma13.

Protocol

me > configuración de la muestra e identificar solo dsDNA tether formación correa suavemente el flujo en 200 X diluido granos M-280, paramagnéticos en la solución de ensayo (100 mM KCl, 2 mM de MgCl 2, 10 mM Tris, pH 7.4 ) en un canal. Incubar durante 10 minutos permitir que los granos que se unen a moléculas de ADN marcada con biotina inmovilizadas en la superficie revestida de SMCC a través del extremo marcado con tiol. Lave suavemente sin tethered cuentas con 20…

Representative Results

El montaje experimental para estirar una sola molécula G4 se muestra en la figura 4. Una secuencia de formación de G4 de monocatenario atravesada entre dos asas del dsDNA fue anclada entre un cubreobjetos y un talón paramagnético. Para encontrar una tira atada solo dsDNA, se realizó un ensayo demasiado incrementando la fuerza en las tasas de carga constante. A menudo se utilizaron tres tipos de mediciones para estudiar el plegamiento y desplegamiento de …

Discussion

Como se describió anteriormente, una plataforma para el estudio de la estabilidad mecánica de la DNA de G4 y las interacciones de la proteína a G4 usando pinzas magnéticas de una sola molécula se divulgan. Acompañando a la plataforma, se desarrollan protocolos eficientes de encontrar anclaje G4 ADN y medición de la dinámica de plegar-desplegar y la estabilidad de la estructura G4 con resolución especial nanómetros. La fijación del plano focal permite control antideriva altamente estable, que es importante para…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen a Meng Pan para corregir el manuscrito. Este trabajo es apoyado por Singapur Ministerio de educación académica investigación fondo de nivel 3 (MOE2012-T3-1-001) a J.Y.; la Fundación Nacional de investigación a través de la mecanobiología Instituto Singapur J.Y.; la Fundación Nacional de investigación, oficina, Singapur del primer ministro, bajo su programa de Investigatorship de la NRF (NRF Investigatorship premio no. NRF-NRFI2016-03 J.Y.; el fondo de Investigación Fundamental para las universidades Central (2017KFYXJJ153) a H. Y.

Materials

DNA PCR primers IDT DNA preparations
DNA PCR chemicals NEB DNA preparations
restriction enzyme BstXI NEB R0113S DNA preparations
coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) BMH.BIOMEDIA 72204 flow channel preparation
Decon90 Decon Laboratories Limited flow channel preparation
APTES Sigma 440140-500ML flow channel preparation
Sulfo-SMCC ThermoFisher Scientific 22322 flow channel preparation
M-280, paramganetic beads,streptavidin ThermoFisher Scientific 11205D flow channel preparation
Polybead Amino Microspheres 3.00 μm Polysciences, Inc 17145-5 flow channel preparation
2-Mercaptoethanol Sigma M6250-250ML flow channel preparation
Olympus Microscopes IX71 Olympus IX71 Magnetic tweezers setup
Piezo-Z Stages P-721 Physik Instrumente P-721 Magnetic tweezers setup
Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X Olympus MPLAPON-Oil 100X Magnetic tweezers setup
CCD/CMOS camera AVT Pike F-032B Magnetic tweezers setup
Translation linear stage Physik Instrumente MoCo DC Magnetic tweezers setup
LED Thorlabs MCWHL Magnetic tweezers setup
Cubic Magnets Supermagnete Magnetic tweezers setup
Labview National Instruments Magnetic tweezers setup
OriginPro/Matlab OriginLab/MathWorks Data analysis
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References

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G-quadruplexMagnetic TweezersSingle-molecule ManipulationFolding And UnfoldingBinding ProteinsDNA-protein InteractionsHelicase ActivityDNA Tether FormationParamagnetic BeadsNanometer-scale Dynamics

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You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. J. Vis. Exp. (127), e56328, doi:10.3791/56328 (2017).
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