JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biochemistry

Enkelt-molekyle Manipulation af G-quadruplexes af magnetiske pincet

Published: September 19, 2017
doi:
10.3791/56328
, , , ,
1School of Pharmacy, Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology, 2Mechanobiology Institute,National University of Singapore, 3Department of Physics,National University of Singapore, 4Research Institute for Biomimetics and Soft Matter, Fujian Provincial Key Lab for Soft Functional Materials Research, Department of Physics,Xiamen University, 5Center for Bioimaging Sciences,National University of Singapore

Summary

En enkelt-molekyle magnetiske pincet platform til at manipulere G-quadruplexes er rapporteret, som giver mulighed for undersøgelse af G4 stabilitet og regulering af forskellige proteiner.

Abstract

Ikke-kanoniske nukleinsyre sekundærstruktur G-quadruplexes (G4) er involveret i forskellige cellulære processer, såsom DNA-replikation, transskription, RNA forarbejdning og telomere brudforlængelse. Under disse processer, forskellige proteiner binde og løse G4 strukturer til at udføre deres funktion. Funktionen af G4 ofte afhænger af stabiliteten i sine foldede struktur, er det vigtigt at undersøge, hvordan G4-bindende proteiner regulere stabilitet af G4. Dette arbejde præsenterer en metode til at manipulere enkelt G4 molekyler ved hjælp af magnetiske pincet, som giver studier af reguleringen af G4-bindende proteiner på en enkelt G4 molekyle i realtid. I almindelighed, er denne metode velegnet til et bredt anvendelsesområde applikationer i undersøgelser for proteiner/ligander interaktioner og forordninger om forskellige DNA eller RNA sekundære strukturer.

Introduction

Fire-strenget DNA eller RNA G4 strukturer spiller en kritisk rolle i mange vigtige biologiske processer1. Mange proteiner er involveret i G4 bindende og regulering, herunder Telomer-bindende proteiner (telomerase, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)1,2, transskriptionsfaktorer (nucleolin, PARP1)3, RNA forarbejdning proteiner (hnRNP A1, hnRNP A2)4, helicases (BLM, FANCJ, RHAU, WRN, Dna2, Pif1)5og DNA-replikation relaterede proteiner (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. Protein binding kan stabilisere eller destabilisere G4 strukturer; dermed regulerer de efterfølgende biologiske funktioner. Stabiliteten af G4 blev målt ved termisk smelter ved hjælp af ultraviolet (UV) eller cirkulær dichroism (CD) metoder7. Sådanne forhold er imidlertid ikke fysiologisk relevante og er vanskelige at anvende til at studere virkningerne af bindende proteiner7.

Den hurtige udvikling i enkelt-molekyle manipulation teknologier har aktiveret undersøgelser af folde og udfoldelsen af et biomolekyle, såsom en DNA eller et protein, på en enkelt-molekyle niveau med nanometer opløsning i realtid8. Atomic force mikroskopi (AFM), Optisk pincet og magnetiske pincet er de mest almindeligt anvendte metoder til enkelt-molekyle manipulation. I forhold til AFM og optiske pincet9, tillade magnetiske pincet stabile målinger af folde udfoldning dynamikken i et enkelt molekyle over dage ved hjælp af en anti-drift teknik10,11.

Her, er en enkelt-molekyle manipulation platform ved hjælp af magnetiske pincet til at undersøge regulering af G4 stabilitet af bindende proteiner rapporteret12,13. Dette arbejde skitserer de grundlæggende metoder, herunder prøve og flow-kanal forberedelse, opsætning af magnetiske pincet og kraft kalibrering. Kontrolelementet kraft og protokollerne anti-drift som beskrevet i trin 3 giver mulighed for lang tidsmålinger under forskellige kraft kontrolelementer, som konstant kraft (force klemme) og konstant lastning Vurder (kraft-rampe) og force-jump måling. Kraft kalibrering protokollen beskrevet i trin 4 giver kraft kalibrering af < 1 µm kort bindsler over en bred kraft rækkevidde op til 100 pN, med en relativ fejl inden for 10%. Et eksempel på lovgivning om stabilitet af RNA-Helicase forbundet med AU-rige element (RHAU) helicase (alias DHX36, G4R1), spiller væsentlige roller i løsningen af RNA G4 bruges til at demonstrere applikationer på denne platform13.

Protocol

1. forberedelse af G4 DNA for enkelt-molekyle strækning Forbered 5 '-thiol mærket og 5 '-biotin mærket dsDNA håndtag ved PCR ved hjælp af DDNA polymerase på en lambda phage DNA skabelon ved hjælp af 5 '-thiol og 5 '-biotin primere 14 ( figur 1). Begge dsDNA håndtag har højt indhold af GC (> 60%) for at forhindre DNA smelter når DNA holdes på høje styrker eller under DNA overstretching overgang 15.</l…

Representative Results

Opsætningen eksperiment for at strække en enkelt G4 molekyle er vist i figur 4. En enkelt-strenget G4 danner sekvens strakte sig mellem to dsDNA håndtag var bundet mellem et coverslip og en Paramagnetiske perle. For at finde en enkelt dsDNA tøjret perle, blev en overstretching analyse udført ved at øge kraft til konstant ladning priser. Tre typer af målinger blev ofte brugt til at studere folde og udfoldelsen af biomolekyler: (i) konstant kraft måling…

Discussion

Som beskrevet ovenfor, en platform for at studere den mekaniske stabilitet af G4 DNA og samspillet mellem protein til G4 ved hjælp af er enkelt-molekyle magnetiske pincet rapporteret. Ledsager platformen, er højeffektive protokoller for at finde G4 DNA tether og måling af folde udfoldning dynamik og stabilitet af G4 struktur med nanometer særlig beslutning udviklet. Brændplanet låsning muliggør yderst stabil anti-drift kontrol, hvilket er vigtigt for påvisning af en lille struktur overgang som G4 (trin størrelse…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne takke Meng Pan til korrekturlæsning af håndskriftet. Dette arbejde er støttet af Singapore Ministeriet for uddannelse akademisk forskning fond Tier 3 (MOE2012-T3-1-001) til J.Y.; Grundforskningsfond gennem Mechanobiology Institut Singapore til J.Y.; Danmarks Grundforskningsfond, premierministerens kontor, Singapore, under sit NRF Investigatorship program (NRF Investigatorship Award nr. NRF-NRFI2016-03 til J.Y.; den grundlæggende forskningsfonden for Central universiteterne (2017KFYXJJ153) til H. Y.

Materials

DNA PCR primers IDT DNA preparations
DNA PCR chemicals NEB DNA preparations
restriction enzyme BstXI NEB R0113S DNA preparations
coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) BMH.BIOMEDIA 72204 flow channel preparation
Decon90 Decon Laboratories Limited flow channel preparation
APTES Sigma 440140-500ML flow channel preparation
Sulfo-SMCC ThermoFisher Scientific 22322 flow channel preparation
M-280, paramganetic beads,streptavidin ThermoFisher Scientific 11205D flow channel preparation
Polybead Amino Microspheres 3.00 μm Polysciences, Inc 17145-5 flow channel preparation
2-Mercaptoethanol Sigma M6250-250ML flow channel preparation
Olympus Microscopes IX71 Olympus IX71 Magnetic tweezers setup
Piezo-Z Stages P-721 Physik Instrumente P-721 Magnetic tweezers setup
Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X Olympus MPLAPON-Oil 100X Magnetic tweezers setup
CCD/CMOS camera AVT Pike F-032B Magnetic tweezers setup
Translation linear stage Physik Instrumente MoCo DC Magnetic tweezers setup
LED Thorlabs MCWHL Magnetic tweezers setup
Cubic Magnets Supermagnete Magnetic tweezers setup
Labview National Instruments Magnetic tweezers setup
OriginPro/Matlab OriginLab/MathWorks Data analysis
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rhodes, D., Lipps, H. J. G-quadruplexes and their regulatory roles in biology. Nucleic Acids Res. 43 (18), 8627-8637 (2015).
  2. Brazda, V., Haronikova, L., Liao, J. C., Fojta, M. DNA and RNA quadruplex-binding proteins. Int J Mol Sci. 15 (10), 17493-17517 (2014).
  3. Gonzalez, V., Hurley, L. H. The C-terminus of nucleolin promotes the formation of the c-MYC G-quadruplex and inhibits c-MYC promoter activity. Biochemistry. 49 (45), 9706-9714 (2010).
  4. Wang, F., et al. telomerase-interacting protein that unfolds telomere G-quadruplex and promotes telomere extension in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), 20413-20418 (2012).
  5. Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).
  6. Schiavone, D., et al. PrimPol Is Required for Replicative Tolerance of G Quadruplexes in Vertebrate Cells. Mol Cell. 61 (1), 161-169 (2016).
  7. Lane, A. N., Chaires, J. B., Gray, R. D., Trent, J. O. Stability and kinetics of G-quadruplex structures. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5482-5515 (2008).
  8. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy. Annu Rev Biophys. 43, 19-39 (2014).
  9. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  10. Chen, H., et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA. Biophys J. 100 (2), 517-523 (2011).
  11. Chen, H., et al. Dynamics of equilibrium folding and unfolding transitions of titin immunoglobulin domain under constant forces. J Am Chem Soc. 137 (10), 3540-3546 (2015).
  12. You, H., Wu, J., Shao, F., Yan, J. Stability and kinetics of c-MYC promoter G-quadruplexes studied by single-molecule manipulation. J Am Chem Soc. 137 (7), 2424-2427 (2015).
  13. You, H., Lattmann, S., Rhodes, D., Yan, J. RHAU helicase stabilizes G4 in its nucleotide-free state and destabilizes G4 upon ATP hydrolysis. Nucleic Acids Res. 45 (1), 206-214 (2017).
  14. You, H., et al. Dynamics and stability of polymorphic human telomeric G-quadruplex under tension. Nucleic Acids Res. 42 (13), 8789-8795 (2014).
  15. Fu, H., Chen, H., Marko, J. F., Yan, J. Two distinct overstretched DNA states. Nucleic Acids Res. 38 (16), 5594-5600 (2010).
  16. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82 (6), 3314-3329 (2002).
  17. Fu, H., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
  18. Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
  19. Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
  20. Chen, H., et al. Improved High-Force Magnetic Tweezers for Stretching and Refolding of Proteins and Short DNA. Biophys. J. 100 (2), 517-523 (2011).
  21. Fu, H. X., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
  22. Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
  23. Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
  24. Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
  25. Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
  26. De Vlaminck, I., Dekker, C. Recent advances in magnetic tweezers. Annu Rev Biophys. 41, 453-472 (2012).
  27. Yan, J., Skoko, D., Marko, J. F. Near-field-magnetic-tweezer manipulation of single DNA molecules. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 70 (1 Pt 1), 011905 (2004).
  28. Le, S., et al. Disturbance-free rapid solution exchange for magnetic tweezers single-molecule studies. Nucleic Acids Res. 43 (17), e113 (2015).
  29. Neidle, S. Quadruplex Nucleic Acids as Novel Therapeutic Targets. J Med Chem. 59 (13), 5987-6011 (2016).
  30. Simone, R., Fratta, P., Neidle, S., Parkinson, G. N., Isaacs, A. M. G-quadruplexes: Emerging roles in neurodegenerative diseases and the non-coding transcriptome. FEBS Lett. 589 (14), 1653-1668 (2015).
  31. Balasubramanian, S., Hurley, L. H., Neidle, S. Targeting G-quadruplexes in gene promoters: a novel anticancer strategy?. Nat Rev Drug Discov. 10 (4), 261-275 (2011).
  32. Amato, J., et al. Toward the Development of Specific G-Quadruplex Binders: Synthesis, Biophysical, and Biological Studies of New Hydrazone Derivatives. J Med Chem. 59 (12), 5706-5720 (2016).
  33. Wells, R. D. Non-B DNA conformations, mutagenesis and disease. Trends Biochem Sci. 32 (6), 271-278 (2007).

Tags

Keywords: G-quadruplexMagnetic TweezersSingle-molecule ManipulationFolding And UnfoldingBinding ProteinsDNA-protein InteractionsHelicase ActivityDNA Tether FormationParamagnetic BeadsNanometer-scale Dynamics
check_url/56328?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. J. Vis. Exp. (127), e56328, doi:10.3791/56328 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image