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Biochemistry

जी के एकल अणु हेरफेर-चुंबकीय चिमटी द्वारा quadruplexes

Published: September 19, 2017
doi:
10.3791/56328
, , , ,
1School of Pharmacy, Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology, 2Mechanobiology Institute,National University of Singapore, 3Department of Physics,National University of Singapore, 4Research Institute for Biomimetics and Soft Matter, Fujian Provincial Key Lab for Soft Functional Materials Research, Department of Physics,Xiamen University, 5Center for Bioimaging Sciences,National University of Singapore

Summary

जी-quadruplexes में हेरफेर करने के लिए एक एकल अणु चुंबकीय चिमटी मंच की रिपोर्ट है, जो विभिन्न प्रोटीन द्वारा G4 स्थिरता और विनियमन के अध्ययन के लिए अनुमति देता है ।

Abstract

गैर विहित न्यूक्लिक अम्ल माध्यमिक संरचना जी quadruplexes (G4) विविध सेलुलर प्रक्रियाओं में शामिल हैं, जैसे डीएनए प्रतिकृति, प्रतिलेखन, आरएनए प्रसंस्करण, और telomere बढ़ाव. इन प्रक्रियाओं के दौरान, विभिंन प्रोटीन बांध और G4 संरचनाओं को हल करने के लिए अपने कार्य प्रदर्शन । के रूप में g4 के समारोह अक्सर अपनी तह संरचना की स्थिरता पर निर्भर करता है, यह जांच महत्वपूर्ण है कि कैसे g4 बाध्यकारी प्रोटीन g4 की स्थिरता को विनियमित । यह काम एक विधि के लिए एक-g4 अणु चुंबकीय चिमटी, जो वास्तविक समय में एक एकल g4 अणु पर g4 बाध्यकारी प्रोटीन के विनियमन के अध्ययन में सक्षम बनाता है का उपयोग कर में हेरफेर करने के लिए प्रस्तुत करता है । सामांय में, यह विधि प्रोटीन/लाइगैंडों बातचीत और विभिंन डीएनए या आरएनए माध्यमिक संरचनाओं पर नियमों के लिए अध्ययन में आवेदनों की एक विस्तृत गुंजाइश के लिए उपयुक्त है ।

Introduction

चार-असहाय डीएनए या आरएनए G4 संरचनाएं कई महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं1. कई प्रोटीन G4 बाइंडिंग और नियमन में शामिल हैं, जिनमें telomere बाइंडिंग प्रोटीन (टेलोमिरेज, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)1,2, प्रतिलेखन कारक (nucleolin, PARP1)3, आरएनए प्रोसेसिंग प्रोटीन (hnRNP A1, hnRNP A2)4, helicases (BLM, FANCJ, २१औ, WRN, Dna2, Pif1)5, और डीएनए प्रतिकृति संबंधित प्रोटीन (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. प्रोटीन बाध्यकारी G4 संरचनाओं को स्थिर या अस्थिर कर सकते हैं; इस प्रकार बाद में जैविक कार्यों को विनियमित । G4 की स्थिरता थर्मल पिघलने से पराबैंगनी (यूवी) या परिपत्र dichroism (सीडी) तरीकों7का उपयोग करके मापा गया था । हालांकि, ऐसी स्थितियों शारीरिक और प्रासंगिक नहीं है बाध्यकारी प्रोटीन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए लागू करने के लिए मुश्किल है7।

एकल अणु हेरफेर प्रौद्योगिकियों में तेजी से विकास की तह और एक डीएनए या एक प्रोटीन के रूप में एक परमाणु, के खुलासा के अध्ययन सक्षम है, एक एकल-नैनोमीटर संकल्प के साथ एक अणु स्तर पर वास्तविक समय में8। परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM), ऑप्टिकल चिमटी, और चुंबकीय चिमटी सबसे अधिक इस्तेमाल किया एकल अणु हेरफेर तरीके हैं । AFM और ऑप्टिकल चिमटी9की तुलना में, चुंबकीय चिमटी एक विरोधी बहाव तकनीक10,11का उपयोग करके दिनों में एक ही अणु की तह-खुलासा गतिशीलता के स्थिर माप की अनुमति देते हैं ।

यहाँ, एक एकल अणु हेरफेर मंच चुंबकीय चिमटी का उपयोग करने के लिए बंधन प्रोटीन द्वारा G4 स्थिरता के विनियमन का अध्ययन12,13सूचना दी है । इस काम के बुनियादी दृष्टिकोण, नमूना और प्रवाह चैनल तैयारी, चुंबकीय चिमटी के सेटअप, और बल अंशांकन सहित रूपरेखा । बल नियंत्रण और विरोधी बहाव प्रोटोकॉल चरण 3 में वर्णित के रूप में विभिन्न बल नियंत्रण, जैसे निरंतर बल (बल दबाना) और निरंतर लोडिंग दर (बल-रैंप), और बल-कूद माप के तहत लंबे समय तक माप के लिए अनुमति देते हैं । बल अंशांकन प्रोटोकॉल चरण 4 में वर्णित सक्षम करता है के लिए बल अंशांकन & #60; 1 µm एक व्यापक बल पर लघु tethers अप करने के लिए सीमा १०० pN, 10% के भीतर एक रिश्तेदार त्रुटि के साथ. आरएनए-Helicase का समाधान करने में आवश्यक भूमिका निभाने वाले AU-अमीर तत्व (२१औ) Helicase (उपनाम DHX36, G4R1) के साथ जुड़े हुए शाहीन की स्थिरता के विनियमन का एक उदाहरण इस मंच के13आवेदनों के प्रदर्शन के लिए प्रयोग किया जाता है ।

Protocol

1. एकल अणु खींचने के लिए G4 DNA की तैयारी तैयार 5 & #39;-thiol लेबल और 5 & #39;-बायोटिन लेबल dsDNA पीसीआर द्वारा हैंडल DDNA पोलीमरेज़ पर एक लैंब्डा फेज डीएनए टेम्पलेट का उपयोग करके 5 & #39;-thiol और 5 & #39;-बायोटिन प्राइमर < सुप क्लास = …

Representative Results

एक G4 अणु खींच के लिए प्रयोग सेटअप चित्रा 4में दिखाया गया है । एक एकल-किनारा G4 बनाने अनुक्रम दो dsDNA संभालती के बीच फैले एक coverslip और एक paramagnetic मनका के बीच सीमित किया गया था । एक एकल dsDNA सीमित म…

Discussion

जैसा कि ऊपर वर्णित है, g4 डीएनए की यांत्रिक स्थिरता और एक अणु चुंबकीय चिमटी का उपयोग कर g4 के लिए प्रोटीन की बातचीत के अध्ययन के लिए एक मंच की सूचना है । मंच के साथ, g4 डीएनए तार खोजने के अत्यधिक कुशल प्रोटोकॉल…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

लेखकों ने पांडुलिपि को ठीक करने के लिए मेंग पैन का शुक्रिया अदा किया । यह काम सिंगापुर शिक्षा मंत्रालय के अकादमिक अनुसंधान कोष टीयर 3 (MOE2012-T3-1-001) से J.Y. के लिए समर्थित है; Mechanobiology संस्थान सिंगापुर के माध्यम से नेशनल रिसर्च फाउंडेशन को J.Y.; नेशनल रिसर्च फाउंडेशन, प्रधानमंत्री कार्यालय, सिंगापुर, इसके एनआरएफ Investigatorship कार्यक्रम के तहत (एनआरएफ Investigatorship अवार्ड सं. एनआरएफ-NRFI2016-03 to J.Y.; केंद्रीय विश्वविद्यालयों के लिए मौलिक अनुसंधान निधि (2017KFYXJJ153) को एच. वाय.

Materials

DNA PCR primers IDT DNA preparations
DNA PCR chemicals NEB DNA preparations
restriction enzyme BstXI NEB R0113S DNA preparations
coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) BMH.BIOMEDIA 72204 flow channel preparation
Decon90 Decon Laboratories Limited flow channel preparation
APTES Sigma 440140-500ML flow channel preparation
Sulfo-SMCC ThermoFisher Scientific 22322 flow channel preparation
M-280, paramganetic beads,streptavidin ThermoFisher Scientific 11205D flow channel preparation
Polybead Amino Microspheres 3.00 μm Polysciences, Inc 17145-5 flow channel preparation
2-Mercaptoethanol Sigma M6250-250ML flow channel preparation
Olympus Microscopes IX71 Olympus IX71 Magnetic tweezers setup
Piezo-Z Stages P-721 Physik Instrumente P-721 Magnetic tweezers setup
Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X Olympus MPLAPON-Oil 100X Magnetic tweezers setup
CCD/CMOS camera AVT Pike F-032B Magnetic tweezers setup
Translation linear stage Physik Instrumente MoCo DC Magnetic tweezers setup
LED Thorlabs MCWHL Magnetic tweezers setup
Cubic Magnets Supermagnete Magnetic tweezers setup
Labview National Instruments Magnetic tweezers setup
OriginPro/Matlab OriginLab/MathWorks Data analysis
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References

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Keywords: G-quadruplexMagnetic TweezersSingle-molecule ManipulationFolding And UnfoldingBinding ProteinsDNA-protein InteractionsHelicase ActivityDNA Tether FormationParamagnetic BeadsNanometer-scale Dynamics
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You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. J. Vis. Exp. (127), e56328, doi:10.3791/56328 (2017).
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