Denne protokol undersøgelser af chemokine (C-C motiv) ligand 5 (CCL5) i hypothalamus rolle ved at levere en antagonist, MetCCL5, ind i musen hjernen ved hjælp af en mikro-osmotisk pumpe hjernen infusion system. Denne forbigående hæmning af CCL5 aktivitet afbrudt hypothalamus insulin signalering, fører til glukose intolerance og perifere systemisk insulinfølsomhed.
Insulin regulerer systematisk stofskifte i hypothalamus og perifer insulin reaktion. En betændelsesreaktion i perifere fedtvæv bidrager til type 2 diabetes mellitus (T2DM) udvikling og appetit reguleringen i hypothalamus. Chemokine CCL5 og C-C chemokine receptor type 5 (CCR5) niveauer har været foreslået for at mægle åreforkalkning og glukose intolerance i type 2 diabetes mellitus (T2DM). Derudover spiller CCL5 en neuroendokrine rolle i hypothalamus ved at regulere mad indtag og krop temperatur, således at spørge os at undersøge dets funktion i hypothalamus insulin signalering og regulering af perifere glukosemetabolismen.
Mikro-osmotisk pumpe hjernen infusion system er en hurtig og præcis måde at manipulere CCL5 funktion og studere dens virkning i hjernen. Det giver også en praktisk alternativ fremgangsmåde til at generere en transgene knockout dyr. I dette system, blev CCL5 signalerer blokeret af intracerebroventricular (ICV) infusion af dens antagonist, MetCCL5, ved hjælp af en mikro-osmotisk pumpe. Den perifere glukose metabolisme og insulin lydhørhed var opdaget af Oral glukose Tolerance Test (OGTT) og Insulin Tolerance Test (ITT). Insulin signalering aktivitet blev derefter analyseret af protein skamplet fra vævsprøver fra dyr.
Efter 7-14 dage af MetCCL5 infusion, glukose metabolisme og insulin var lydhørhed nedsat hos mus, som det fremgår af resultaterne af OGTT og ITT. IRS-1 serine302 fosforylering blev øget og Akt aktivitet blev reduceret i mus hypothalamus neuroner efter CCL5 hæmning. Helt, vores data tyder på, at blokerer CCL5 i hjernen, mus øger fosforylering af IRS-1 S302 og afbryder hypothalamus insulin signalering, fører til et fald i insulin funktion i perifere væv samt værdiforringelse af glukose metabolisme.
Insulin berører en bred vifte af væv, herunder hjernen. Insulin passerer gennem blod – hjerne barrieren, træder det centrale nervesystem (CNS) og binder med insulin receptor (IR) i hypothalamus til at regulere fødeindtagelse, sympatisk aktivitet og perifer insulin reaktion. Kronisk betændelse i perifere fedtvæv er blevet foreslået at bidrage til type 2 diabetes mellitus (T2DM), men hvordan disse inflammatoriske reaktioner påvirker insulin signaler i hypothalamus at mægle systemisk insulin reaktion og glukose intolerance uklart. Nogle kemokiner deltage i appetit regulering og kropstemperatur regulering i hypothalamus1, såsom tumor nekrose faktor-alfa (TNFα), interleukin (IL) -6, IL-1β, monocyt chemoattractant protein-1 (MCP-1) og CCL5 (C-C motiv ligand 5 ). Derudover fører betændelse i hypothalamus til insulinresistens i T2DM2,3.
Blandt disse kemokiner, ændring af udtryk niveauer af chemokine CCL5 og dens receptor, har CCR5, i fedtvæv været forbundet med åreforkalkning og glukose intolerance i T2DM i såvel mennesker som dyr. CCL5 har også neuroendokrine funktioner, herunder reguleringen af fødevarer indtagelse og krop temperatur, i hypothalamus. Det er således vigtigt at undersøge, om CCL5 deltager i insulin signal aktivering i hypothalamus eller perifere væv.
Insulin signalering er stramt reguleret i celler. Binding af insulin til insulin receptorer (IR) aktiveres insulin receptor substrat (IRS) proteiner, efterfulgt af phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) og protein kinase B (PKB/AKT) aktivering og glucose transporter-4 (GLUT4) membran translokation4 . IRS proteiner er de centrale myndigheder i denne signalvejen: de har flere tyrosin og serin restkoncentrationer, som kan blive fosforyleret reaktion på positive eller negative insulin signaler5. For eksempel, kan Serin 302 fosforylering på IRS-1 føre til fysisk dissociation af IRS-1 fra IR og blokere insulin signaltransduktion, fører til insulin resistens6. Aktivitet er krænket af IRS proteiner i hypothalamus har vist sig at fremkalde insulinresistens og glukose intolerance i mus7.
En fælles måde at studere funktionen af et bestemt gen er manipulation af udtryk for target gener fordelt over hele kroppen af organismen. Dette kan dog have flere ulemper: 1) det kan generere forskellige feedback regulerende eller kompenserende virkninger over tid og 2) denne metode ikke hjælpe os med at illustrere rollen af target proteinet i de specifikke hjerneregioner. Også, væv og celler bestemt gen knockout dyr tage lang tid at avle og er dyre. Dermed, vi bruger en kortsigtet hjernen infusion osmotisk pumpesystem – en relativt hurtig og bekvem måde forstyrrer signalering af target proteinet i hjernen bruger antagonist stof til at overvinde de førnævnte spørgsmål. Stereotactic injektioner anvendes til at kræve indviklede kirurgiske færdigheder og omfattende investeringer i instrumentation og tid. I denne protokol leverer vi en enkel og sikker måde at foretage stereotactic injektion og en hurtig, mindre skadelige og øjeblikkelig metode til at finde koncentrationen af blodsukkeret og undersøge rollen som CCL5 i hypothalamus insulin signalering forordning.
Mekanismen af kronisk inflammation og relaterede kemokiner som CCL5 og dens receptor-CCR5 i udviklingen af type 2 diabetes er fortsat uklart. Kronisk inflammation forårsager makrofag perkolatnedsivning i fedtvæv og påvirker forordningen af adipokines; i mellemtiden har det også tiltrækker β-celler og svækker insulinsekretion fra Holme i Langerhanske svar blodglukose. Hypothalamus i hjernen spiller en vigtig rolle som et kontrolcenter i koordineringen af insulin og adipokine signaler fra de systemiske perifere væv i regulerer appetit, perifert blod glukose metabolisme og insulin reaktion. Mange undersøgelser tyder også på at hypothalamus betændelse fører til defekte regulering af energi homøostase samt defekt pancreas Holmen og leverfunktionen2,3,9,10. CCL5 i hjernen bidrager til mad indtag og kroppens varmeregulering i hypothalamus11,12; Korrelation af CCL5 til hypothalamus og systemisk insulin signalering er dog uklart. En CCL5 hele kroppen knockout mus (CCL5– / –) er oprettet for at løse dette spørgsmål, som viser en insulin resistens fænotype med højere insulin niveauer og højt blodsukkerniveau i blodet8. Men det kræver lang tid at udvikle T2DM fænotype og det er vanskeligt at undersøge den rolle og mekanisme af CCL5 i hypothalamus insulin signal på grund af mulige langsigtede kompenserende virkninger. En direkte manipulation af CCL5 signalering i hypothalamus neuroner er derfor den bedste tilgang. Der er dog flere typer for neuroner i hypothalamus regionen og det er temmelig dyrt og tidskrævende at generere celle specifikke knockout mus. Udnytte en ICV kan infusion systemet således spare tid og giver en mere specifik tilgang for at manipulere CCL5 funktion direkte i hjernen, omgåelse mulig perifere inflammatoriske reaktioner.
Undersøgelser udnytte osmotisk pumper er allerede blevet offentliggjort tidligere, giver gode eksempler og demonstrationer af teknikker involveret i implantation af osmotisk pumper i gnavere13. Men vi står over for nogle udfordringer mens efter disse protokoller i vores undersøgelse. Først, noget af det udstyr, der anvendes i protokollen er ret dyrt, herunder 1) elektriske system for at nå frem til den placering, tegning og indsætte nålen ind i musen hjerne, 2) thermo-systemet for at opretholde mus kropstemperatur og 3) ilt-isofluran levere system til forvaltning af anæstesi til mus. For det andet var de teknikker, der er beskrevet i andre artikler vanskelige at replikere, fordi vi har kun kunnet bruge dyr inden for et lille område af kroppen vægte og på visse alder for vores undersøgelse. Vi er klar over, at større mus er mere egnet til kirurgi og implantation. Men i vores undersøgelse, havde vi til at bruge mindre og yngre musene for at undgå overvægt og aging virkninger på insulin og glukose forordning: kun mandlige mus med kroppen vægt 25 ± 2 g og alder omkring 2 måneder gammel blev valgt i undersøgelsen. Det er således vanskeligt at udføre kirurgi og sutur sår på musen hovedet. For det tredje har det inflammatoriske respons at blive minimeret efter operationen, da en inflammatorisk cytokin er målet i denne undersøgelse. Mus og rotter kan fjerne sutur og åbne sår nemt efter operationen, hvilket vil forårsage betændelse og øge chemokine reaktioner. En strategi for at nå placeringen og trække og indsætte nålen ind i musen hjerne, der undgår sekundær infektion er derfor nødvendigt. Derfor ændrede vi de tidligere beskrevne protokoller for at gøre denne teknik omkostningseffektive, lettere og mindre skadelige for dyrene, som beskrevet i følgende afsnit.
For det første, vi brugte en søm boremaskine til manuelt bore et hul omkring målområdet markeret på kraniet, som beskrevet i trin 2.6. Denne metode er omkostningseffektive og giver mulighed for at overvåge hele proceduren for at undgå at beskadige mus meninges og blodkar. Blod glucose regulering er nedsat efter akut stroke, såsom en blødning i hjernen. Akut hyperglykæmi og diabetes-lignende syndromer blev også observeret efter slagtilfælde i klinisk indstillinger14,15. Ligeledes, vi også fundet nedsat glukose niveau og insulin reaktion i mus med blødning og pus i hjernen. Vi er klar over, at bedre kontrol med manual-baserede kirurgi er nødvendigt for at sikre konsekvens af resultaterne. For det andet, vi tog fordel af en nyudviklet medicinsk biomateriale almindeligt anvendt i klinikker, væv klæbende lim (trin 2.8), for at forsegle huden på musen hovedet efter en operation, derfor undgå Sting og fremskynde hastigheden af healing. Dette gør det lettere at udføre kirurgiske indgreb og reducerer risikoen for sekundær inflammation. For det tredje, tidsforbruget til at udføre hele den kirurgiske procedure er forholdsvis kortere, hvilket øger chancen for overlevelse for mus og sænker dosering af bedøvende stof bliver sprøjtet intraperitoneal. Vi observeret en høj overlevelse (95%) og opnået relativt præcise resultater ved at følge denne ændrede protokol.
Begrænsning af denne teknik er den relativ kort tidsramme for drug delivery. Selv om en osmotisk pumpe kan placeres i selve musen alternativt uden genåbning hjerne, vores undersøgelse kun fokuserer på inflammatoriske chemokine virkning på hjernen til at regulere den perifere systemisk insulin signalering. Yderligere kirurgi i perifere væv kunne eventuelt inducere en inflammatorisk reaktion i perifere væv, som derefter vil øge inflammatoriske chemokine udtryk og påvirker resultaterne. For det andet, half-life af stoffet også begrænser varigheden af undersøgelsen. Rekombinante proteiner som chemokine har normalt en kortere halveringstid, som mister sin aktivitet over tid, selvom det også giver os mulighed at studere effekten af blokerende CCL5 signalering i hjernen på kort sigt. Vores tidligere undersøgelser har også beskrevet en genetisk modifikation tilgang til at generere en CCL5 knockout mus, som giver en model med langsigtede virkninger8.
Der er nogle nye teknikker og alternative metoder til at levere medicin til hjernen. Nanoteknologien er en kraftfuld teknik, som kan bruges til at levere lægemidler til centralnervesystemet. Men mange stoffer er thermosensitive og kan blive ødelagt, når de forsøger at pakke dem ind i nanopartikler16. Derudover nanopartikler kan passere gennem BBB og være uptaken af celler, der er egnet til siRNA eller mest almindelige lægemidler, men det er ikke en ideel metode til ligand-receptor binding.CCL5 kræver binding til dens receptor, CCR5, i hypothalamus ARC neuroner til at tage effekt8, og levering af CCL5 antagonist MetCCL5 til neuroner gennem nanopartikler kan medføre tab af evnen til at binde og blokere CCR5 på cellen overflade.
Blod glukose niveau var betydeligt højere i mus administreres med CCL5-antagonist MetCCL5 i forhold til kontrol (mus administreres med aCSF) i oral glukose tolerance test. Ekstra insulin administration (insulin toleranceforsøg) var også ude af stand til at sænke den blodsukker niveau i MetCCL5 modtager mus (figur 4B), hvilket tyder på, at både endogene og eksterne insulin ikke kan reducere blodsukkerniveauet Når blokering af hypothalamus CCL5 signalering. Mus blev insulin resistente uden CCL5 aktivitet i hypothalamus. Øget serine302 fosforylering af IRS-1 blev fundet i mus modtage Met-CCL5 i forhold til kontrol mus modtage aCSF (figur 5A-B). Serin 302 fosforylering af IRS-1 har vist sig at fremkalde en fysisk dissociation af IRS-1 fra insulin receptor, som er en væsentlig årsag til insulin resistens6; insulin er afskåret fra aktivere downstream signaler såsom PI3K-Akt vej. En ex vivo insulin stimulation undersøgelse bekræftede insulin downstream signalfunktion molekyle Akt (p-AktS473) ikke blev aktiveret af insulin i mus hypothalamus væv infunderes med Met-CCL5 og i stedet Serin 302 fosforylering steg. Helt, både fysiologiske data (OGTT og ITT) og molekylær undersøgelse viser at hypothalamus CCL5 signalering medierer forordningen hypothalamus insulin signal, som bidrager til systematisk insulin resistens og glukose metabolismen.
Rolle og mekanisme af CCL5 og CCR5 i fedme-associerede diabetes er fortsat uklart. Kitade et al. rapporterede, at CCR5 mangel beskyttet mus fra fedme-induceret inflammation, makrofag rekruttering og insulin resistens17. Men, andre undersøgelser af Kennedy et al. fandt modsatte resultater med angivelse af at CCR5 mangel forringer systemisk glukosetolerance samt adipocyt og muskel insulin signalering18. Begge undersøgelser anvendes en fedtrig kost for at fremkalde fedme, hvilket fører til hele kroppen kronisk inflammation og kompenserende svar. Disse undersøgelser ikke har rene og klare mekanismer af CCL5 og CCR5 i insulin signalering forordning. På den anden side den osmotiske pumpe teknik giver mulighed for en hjerne specifikke infusion og undgår kompensatoriske respons med tidsbegrænset levering.
Til sidst, selvom den osmotiske pumpe med hjernen infusion system synes at være en “gammeldags” teknik, det giver en billigere, lettere og mindre skadelige metode til medicinafgivelse og hjælper med at undersøge funktionen af ligand-receptor signalering i den hjernen.
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for de understøttede fra ministeriet for videnskab og teknologi, Taiwan-MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) og sundhed og velfærd tillæg af tobaksvarer – MOHW106-TDU-B-212-144001 til S-Y C.
Vetbond Tissue Adhesive | 3M | #1049SB | The glue used to seal the lesion site on the mouse head |
LOCTITE 454 instant adhesive | Durect Corporation | #8670 | The glue used to fix the needle on the mouse skull |
Alzet Micro- Osmotic Pump | Durect Corporation | #9922 | 0.11 μl per hour, 28 days |
Brain infusion system | Durect Corporation | #8851 | 1-3 mm, used to perfuse the drug in to the mice brain |
Glucometer | Roche | #06870244001 | Used to measure the blood glucose level |
Glucose chip | Roche | #06454011020 | Used to load the blood sample |
Evan's blue | Sigma | #MKBK0523V | To demonstrate the drug infusion area |
Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | #3232145 C | Used to administer insulin intraperitoneally |
MIO NE116 CONTROL UNIT (nail drill) |
Mio System | #E235-015 | To drill a hole in the skull of the mouse |
CCL5/Met-RANTES Protein | R&D | #ADB0111081 | Recombinant Human CCL5, E-coli derived |
aCSF formula | 119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM glucose |
Filter sterilize with a 0.22 μm filter apparatus, and store at 4°C. aCSF is stable for 3-4 weeks |
|
Phospho-IRS-1 Serine302 antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
IRS-1 (D23G12) antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
Phospho-Akt Serine 473 antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:2000 dilution |
Akt (pan) (C67E7) antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:1000 dilution |
Animals: C57BL/6 | NAR Labs | Wild type mice strain used in the study |