Summary
Här beskriver vi metoder för bedömning av cellulära svar på akut mekanisk stimulering. I mikroskopi-baserade analysen undersöker vi lokalisering av fluorescently-märkta biosensorer kort stimulering med skeva flöde. Vi testar också aktivering av olika proteiner av intresse som svar på akut mekanisk stimulering biokemiskt.
Abstract
Kemotaxis, eller migration upp en gradient av en korrektiv, är bäst förstås läget riktad migration. Studier med sociala amöba Dictyostelium discoideum avslöjade att en komplex signaltransduktion nätverk av parallella vägar förstärker svaret till chemoattractants och leder till partiska aktin polymerisation och utskjutande delen av en pseudopod i den riktning för en övertoning. Däremot är molekylära mekanismer som driver andra typer av riktad migration, till exempel på grund av exponering för skeva flöde eller elektriska fält, inte kända. Många regulatorer av chemotaxisna uppvisar lokalisering på ledande eller släpar migrerar cellens kant, samt Visa övergående förändringar i lokalisering eller aktiveringen globala stimulering med en korrektiv. För att förstå de molekylära mekanismerna av andra typer av riktad migration utvecklat vi en metod som möjliggör undersökning av cellulära svar på akut mekanisk stimulering baserat på kort (2-5 s) exponering för skeva flöde. Denna stimulering kan levereras i en kanal medan imaging celler som uttrycker fluorescently-märkt biosensorer för att undersöka enskilda cellen beteende. Dessutom kan cell befolkningen stimuleras i en tallrik, lyserat, och immunoblotted med antikroppar som känner igen aktiva versioner av proteiner av intresse. Genom att kombinera båda analyser, kan man undersöka en rad olika molekyler som aktiveras av ändringar subcellulär lokalisering eller fosforylering. Med den här metoden vi fast beslutna att akut mekanisk stimulering utlöser aktivering av de kemotaktiska signal transduktion och aktin cytoskelettet nätverk. Möjlighet att undersöka cellulära svar till akut mekanisk stimulering är viktigt för att förstå primärhändelser som är nödvändiga för skjuvning flöde-inducerad motilitet. Detta tillvägagångssätt ger också ett verktyg för att studera kemotaktisk signaltransduktion nätverket utan störande påverkan av korrektiv receptorn.
Introduction
Migrering av eukaryota celler är påverkade av olika kemiska och fysiska ledtrådar i miljön, inklusive lutningar av lösliga eller substrat-bundna chemoattractants, variabla stelhet av substrat, elektriska fält eller skjuvning flöde. Även om det har gjorts många framsteg i vår förståelse av de molekylära mekanismer som driver Kemotaxis, mindre är känt om andra typer av riktad migration och hur dessa olika signaler integreras på cellulär nivå för att producera en enhetlig flyttande svar.
Regisserad migrering mot en ökande koncentrationen av en korrektiv innebär tre beteendemässiga komponenterna: motilitet, riktad avkänning och polaritet1. Motilitet refererar till slumpmässiga rörelsen av celler uppnås genom pseudopod utstick. Riktad avkänning är förmågan hos en cell att hitta källan till en korrektiv, vilket kan ske även i orörlig celler. Polaritet refererar till en mer stabil asymmetrisk fördelning av intracellulära komponenter mellan ledande och släpar kanten av en cell, vilket leder till ökad persistens i rörelse.
Cellulära svar på en korrektiv beror på aktiviteten av fyra begreppsmässigt definierade regleringsnät: receptorn / G protein, signaltransduktion, aktin cytoskelettet och polaritet1. Korrektiv bindande till G-proteinkopplade receptorn skickar signalen via heterotrimeric G proteiner α och βγ till downstream signalera transductionen nätverket, vilket förstärker directional signalen. Flera vägar inom nätverkets signaltransduktion agera parallellt och mata in i aktin cytoskelettet nätverket att bias aktin polymerisation och åtföljande pseudopod utstick, i riktning mot övertoningen. Bland viktiga regulatorer av chemotaxisna är Ras GTPase, TorC2, fosfoinositid 3-Kinas (PI3K), fosfatas och Tenzin homolog (PT) och guanylyl cyclase. Återkopplingsmekanismer inom nätverkets signaltransduktion och mellan signaltransduktion och aktin cytoskelettet nätverk ytterligare förstärka svaret. Slutligen, dåligt definierade polaritet nätverket tar emot input från aktin cytoskelettet och ytterligare biaskällor signaltransduktion nätverk för att främja ihållande migration i riktning mot övertoningen.
Mycket av vår mekanistisk förståelse av chemotaxisna var möjlig på grund av utvecklingen av fluorescently-märkta biosensorer för olika komponenter av de regulatoriska nätverk. Många chemotaxis tillsynsmyndigheter har en asymmetrisk fördelning av reglerande molekylen själv eller dess aktivitet. Till exempel biosensorer som känner igen aktiveras versioner av små GTPases Ras- och Rap1 – Ras-bindande domänerna i Raf1 (kallad RBD här) och RalGDS, respektive – lokalisera till framkanten av en chemotaxing cell2,3. Likaså, PI3K och dess produkt fosfatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PIP3), erkänd av en pleckstrin homologi (PH) domän, visar också lokalisering på framsidan av en cell4,5. Däremot en 3-fosfatas PTEN, som konverterar PIP3 tillbaka till fosfatidylinositol (4,5)-bisphosphate, lokaliserar till släpar kanten av cellen6. Ännu viktigare, ändra dessa biosensorer deras localization som svar på globala stimulering med en korrektiv. Leading edge markörer, som cytosoliska eller på tips av utbuktningar i en vilande cell, relocalize cortex, medan släpar kanten markörer, som har kortikala lokalisering och är frånvarande från tips av utbuktningar i en vilande cell, blir cytosoliska efter stimulering. Analys av biosensor fördelningen som svar på globala stimulering med en korrektiv minimerar motilitet och polaritet, som ofta förväxla observationerna bidrag. Globala eller enhetlig stimulering av en cellsuspension med en korrektiv används också som ett verktyg för att bedöma befolkningen-omfattande förändringar i protein aktivering, ofta upptäcks av protein fosforylering7,8,9 . Denna biokemiska analys används främst för att erhålla temporal information, medan mikroskopi används för att samla både tidsmässiga och rumsliga information om beteendet av olika komponenter av de regulatoriska nätverk.
Nätverkets signaltransduktion innehåller funktioner av en retbara system10,11. Svaren till supra-tröskel kemotaktisk stimuli är ”” och visar refraktärperioder. Svaren utlöses också stochastically och kan visa oscillerande beteende. Signaltransduktion händelser är lokaliserade till områden av hjärnbarken som propagerar som vågor12,13,14,15. Fram eller tillbaka, markörer rekryteras till, eller ta avstånd från, de aktiva zonerna av förökningsmaterial vågorna. På grund av eldfasta regionen avslutande aktiva zonen, förinta oppositely riktas vågorna som de möter. Förökningsmaterial signaltransduktion vågorna ligger bakom de cellulära utbuktningar som förmedlar cell migration10.
Mycket av den ovannämnda informationen på chemotaxis kom från studierna på den sociala amöban Dictyostelium discoideum, även om liknande regleringsmekanismer är också tillämpliga på neutrofiler och andra däggdjursceller typer16 . Dictyostelium är en väletablerad modellorganism som har en robust kemotaktisk svar under svält, när tusentals enstaka celler migrerar en aggregering mitten, så småningom bilda en flercelliga fruiting kropp som innehåller sporer. Chemotaxis är också väsentligt under den encelliga tillväxtfas av denna organism för att lokalisera bakteriell födokällor. Viktigt, är migration av enstaka Dictyostelium celler anmärkningsvärt liknande till migrationen av däggdjur neutrofiler eller metastaserande cancerceller, alla som genomgår mycket snabba amoeboid-typen migration. I själva verket bevaras både övergripande topologin för de regulatoriska nätverk, liksom många av de enskilda cellsmedierade reaktioner deltar i chemotaxis mellan Dictyostelium och däggdjur leukocyter17. Dessutom använda andra celler, till exempel fibroblaster, receptortyrosinkinaser (RTK) i stället för varandra; RTK kan dock matas in liknande nätverk.
I motsats till Kemotaxis saknas grundlig förståelse av de signalering mekanismer som driver olika andra lägen riktad migrationens. Likaså att cellerna migrerar i en korrektiv övertoning flera studier har rapporterat aktivering eller lokalisering av typiska framkant markörer, inklusive aktin polymerisation, PIP3 eller extracellulär signal-reglerade Kinas (ERK) 1/2, på den framsidan av celler som genomgår riktad migration svar på skeva flöde eller förändringar i elektriska fält18,19,20,21. I dessa studier resulterade kontinuerlig exponering för stimulans också dock i cellmigration, lämnar öppna frågan om, till exempel framkant markörerna lokalisera specifikt i respons på ett stimulus, eller om de helt enkelt lokalisera i framkant på grund av ökat antal pseudopods på framsidan av en migrera cell.
Vi utvecklade analyser som tillåter oss att iaktta celler reagerar på akut mekanisk störning levereras som skjuvning flöde både på populationsnivå och som enskilda celler22. Liknar globala stimulering med en korrektiv, akut sktion med skeva flöde tillåter studier av cellulära svar på en mekanisk stimulering utan förbryllande bidrag från motilitet eller polaritet. Att kombinera dessa biokemiska och mikroskopiska analyser med genetiska eller farmakologiska störningar gör det möjligt för oss att lära oss om hur mekaniska stimuli uppfattas och genomlysning. Dessutom ger denna metod också en ny metod för att trycka in i systemet nedströms av korrektiv receptorn i avsaknad av en korrektiv, därmed isolera de signal transduktion och aktin cytoskelettet nätverk från receptorn/G protein nätverk.
Med hjälp av tekniker som beskrivs nedan vi nyligen visat att akut shear stress leder till aktivering av flera komponenter av kemotaktisk signal transduktion och aktin cytoskelettet nätverk22. Genom att tillämpa den akuta mekanisk stimulansen med varierande mellanrum, visade vi att, på samma sätt till chemoattractants, svar på mekaniska stimuli uppvisar också dragen av en retbara systemet, inklusive beteendet för svaret under mättar villkor och närvaron av en refraktärperiod. Slutligen, genom att kombinera mekanisk och kemisk stimulering vi visade att de två stimuli signal transduktion och aktin cytoskelettet nätverk, som sannolikt möjliggör integration av flera stimuli att bias cellmigration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av lösningar
- förbereda HL-5 media använder följande: 10 g/L dextros, 10 g/L proteose pepton, 5 g/L jästextrakt, 0.965 g/L Na 2 HPO 4 ·7H 2 O, 0.485 HB KH 2 PO 4, och, om inte annat anges, 0,03 g/L streptomycin i avjoniserat vatten. Autoklav medium och förvara i rumstemperatur.
Obs: På grund av skillnader mellan proteose pepton och jäst extrakt förvärvade från olika leverantörer samt mellan enskilda partier, pH av media kan behöva justeras till typiska utbud av 6,4 till 6,7. - Förbereda SM plattor som använder följande: 10 g/L dextros, 10 g/L pepton, 1 g/L jäst extrakt, 2.31 HB KH 2 PO 4, 1 g/L K 2 HPO 4 och 20 g/L agar i avjoniserat vatten. Autoklav, svalka, och häll 30 mL agar lösning per 10-cm petriskål. När agar stelnar, lagra plattorna vid 4 ° C i upp till 1 månad.
- Förbered 10 x fosfat buffert (PB) med 13,4 g/L Na 2 HPO 4 ·7H 2 O och 6,8 HB KH 2 PO 4 i avjoniserat vatten. Lagra 10 x beståndet vid 4 ° C. Dilute till 1 x med avjoniserat vatten för användning.
- Förbereda DB buffert genom att komplettera 1 X PB med 2 mM MgSO 4 och 0,2 mM CaCl 2.
- Förbered 100 mM koffein i avjoniserat vatten. Lagra på − 20 ° C.
- Förbereda 100 mM cAMP stamlösning av upplösning cAMP salt natriummonohydrat i avjoniserat vatten. Förbereda en 1 mM arbetar lager i avjoniserat vatten. Lagra båda lager lösningar på − 20 ° C. förbereda sista lägret lösning på önskad koncentration i DB på dagen för experimentet.
Obs: Lager lösningar kan vara frysning-tinade några gånger. - Förbereda 25 mM folsyra i 1 x PB. Tillsätt några droppar 1 N NaOH tills pulvret helt löses upp. Lagra på − 20 ° C.
- Förbereda 3 x provet buffert med följande: 187,5 mM Tris-HCl pH 6.8, 6% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS), 30% glycerol, 126 mM Ditiotreitol och 0,03% (w/v) bromofenolblått. Delprov och butiken på − 20 ° C.
- Före att använda, Tina i 37 ° C vattenbad och tillreder prov buffert med proteas och fosfatas-hämmare genom att späda ut 3 x till 1 x buffert på prov, och lägga till 50 mM NaF, 2 mM Na 3 VO 4, 25 mM natrium pyrofosfat och 1 x komplett EDTA-fria proteashämmare cocktail i avjoniserat vatten. Lägg till hämmare omedelbart innan du startar proceduren som beskrivs i steg 3.1.2-3.1.3.
- Förbereda 5 mM Latrunculin A lösning i DMSO. Delprov och butiken på − 20 ° C.
2. Beredning av D. discoideum celler
Obs: upprätthålla D. discoideum celler i HL-5 media antingen i vävnadsodling tallrikar eller i en suspension kultur som tidigare beskrivs 23. Vid behov, omvandla celler med fluorescently-märkt biosensorer enligt standard elektroporation protokoll 24. D. discoideum stammar, samt olika och plasmider kodning biosensorer eller andra gener av intresse kan erhållas från Dicty lager Center (dictybase.org).
- Tillväxt och samling vegetativt D. discoideum celler
- för analys av vegetativa celler, odla cellerna i närvaro av bakterier för att minska antalet macropinosomes, som vanligtvis observeras i axenically odlade celler 25.
- Förbered en kultur av Klebsiella aerogenes genom att vaccinera ett litet antal celler från en glycerol lager eller från en tidigare kultur till önskad volym av HL-5 medium utan antibiotika. Inkubera bakteriekulturen i orbitalskak på 200 rpm (0,42 x g) vid rumstemperatur (20-22 ° C) för 16-18 h.
Obs: Den K. aerogenes stam används här är icke-patogena (se Tabell för material).
- Förbered en kultur av Klebsiella aerogenes genom att vaccinera ett litet antal celler från en glycerol lager eller från en tidigare kultur till önskad volym av HL-5 medium utan antibiotika. Inkubera bakteriekulturen i orbitalskak på 200 rpm (0,42 x g) vid rumstemperatur (20-22 ° C) för 16-18 h.
- Samla D. discoideum i exponentiell fas antingen från vävnadsodling tallrikar eller en suspension kultur, och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer enligt tillverkaren ' anvisningar. Sprida 1 x 10 5 D. discoideum celler med 260 µL K. aerogenes fjädring på en SM-tallrik. Vänd plattan upp och ner nästa dag. Växa celler i rumstemperatur tills D. discoideum cellerna börja rensa bakteriell gräsmattan men innan de börjar aggregerar (~ 36-48 h).
- Samla D. discoideum celler i 5 mL DB buffert genom att skrapa dem med en glas-spridare. Överföra celler till en 50 mL polypropylen tub. Skölj plattan med en annan 5 mL DB buffert och pool med original fjädring. Fyll röret till 50 mL med DB buffert.
- Centrifug D. discoideum suspensionen vid 360 x g för 3-4 min. som Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 50 mL DB buffert. Upprepa stegen för tvätt tills supernatanten är klart (~ 3-4 tvättar). Återsuspendera cellpelleten sista i DB buffert till en slutlig densitet på ~ 5 x 10 6 celler/mL.
- för analys av vegetativa celler, odla cellerna i närvaro av bakterier för att minska antalet macropinosomes, som vanligtvis observeras i axenically odlade celler 25.
- Beredning av Aggregation-behöriga D. discoideum celler
- utveckla D. discoideum celler av 1 h svält följt av 4 h av svält och pulserande med 50 nM cAMP var 6 minut enligt standard protokoll 23.
- Efter utveckling, mäta slutvolymen av cellsuspensionen.
- Baserat på det ursprungliga antalet celler som används för utveckling, beräkna cell densiteten av den slutgiltiga suspensionen.
Obs: Om cAMP levereras i 100 µL volymer varje 6 min, cellvolym ökar med 1 mL för varje timme av cAMP pulserande. Således för de standardvillkor som använder 8 x 10 7 celler i 4 mL DB, efter 4 timmar av utveckling den slutliga volymen är 7 mL och sista cell densiteten är ~1.1 x 10 7 celler/mL.
3. Biokemisk analys av cellssvar på mekanisk eller kemisk stimulering
- Akut mekanisk stimulering av celler följt av Cell Lysis
- plattan 2 x 10 6 aggregation-kompetenta celler (från steg 2.2) efter 4 h i utveckling i 35-mm rätter med 2 mL DB. Att cellerna att fästa under 10 minuter vid rumstemperatur. Tvätta cellerna två gånger med 1 mL DB. Inkubera cellerna i DB med 2,5 mM koffein i 30 min utan störningar på plattorna.
Obs: Om celler behöver behandlas med en farmakologiska hämmare, lägga till önskad koncentration av hämmare eller samma volym av lämpliga fordon under basalation med koffein. - Att tillämpa mekanisk stimulering, placera plattan (en i taget) i orbitalskak och omedelbart aktivera det på 150 rpm (0.24 x g) för 5 s.
Obs: Plattan kan också manuellt stimuleras av rörelse i ett kors sätt för cirka 5 s. - Aspirera bufferten på den angivna tider efter starten av stimulering. Omedelbart lysera celler genom att lägga till 100 µL prov buffert med proteas och fosfatas hämmare.
- Placera plattan på is, och samla den lysate i ett 1,5 mL rör. För ' tid 0 ', lyse celler utan att skaka. Överföra rören till ett 95 ° C värme block i 10 min direkt efter Lys. Fortsätt med immunoblotting eller lagra lysates på -20 ° C.
- plattan 2 x 10 6 aggregation-kompetenta celler (från steg 2.2) efter 4 h i utveckling i 35-mm rätter med 2 mL DB. Att cellerna att fästa under 10 minuter vid rumstemperatur. Tvätta cellerna två gånger med 1 mL DB. Inkubera cellerna i DB med 2,5 mM koffein i 30 min utan störningar på plattorna.
- Stimulering av celler med en korrektiv
- Basalate aggregation-kompetenta celler efter 4 h utveckling genom att snabbt skaka dem i närvaro av 5 mM koffein på 200 rpm (0,42 x g) i orbitalskak i 30 min.
- Centrifug cellsuspension på 360 x g för 3-4 min. som Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 10 mL iskallt DB buffert. Upprepa detta tvätt.
- Återsuspendera cellpelleten sista i iskall DB buffert till slutliga densitet på 4 x 10 7 celler/mL baserat på den inledande cell nummer används för att utveckla cellerna (se steg 2.2). Hålla cellsuspension på is före stimulationen.
- Pipett 50 µL 10 µM cAMP eller fordon i en polystyren kopp placeras i orbitalskak.
- För att stimulera cellerna, tillsätt 450 µL av iskall cellsuspensionen i samma bägare och omedelbart aktivera shaker på 200 rpm (0,42 x g). Vid olika tidpunkter efter starten av stimulering (t.ex. 10, 30, 45, 60, 120 s), kort stoppa shaker, ta ut 50 µL portioner av cellsuspensionen och lysera celler genom att lägga dem till 1,5 mL rör som innehåller 25 µL 3 X provet buffert.
- För ' tid 0 ', använda cellerna från ostimulerade iskall cellsuspensionen.
Obs: Den slutliga temperaturen av cellsuspensionen vid stimulering är ~ 9 ° C 26. Under dessa förhållanden uppstår den maximala belastningen något senare än den toppen som observerats för stimulering utförd vid rumstemperatur (exempelvis korrektiv stimulering av vidhäftande celler på mikroskopet eller mekanisk stimulering av vidhäftande celler).
- För ' tid 0 ', använda cellerna från ostimulerade iskall cellsuspensionen.
- Överföra rören till ett 95 ° C värme block i 10 min direkt efter Lys. Fortsätt med immunoblotting eller lagra lysates på -20 ° C.
- Basalate aggregation-kompetenta celler efter 4 h utveckling genom att snabbt skaka dem i närvaro av 5 mM koffein på 200 rpm (0,42 x g) i orbitalskak i 30 min.
- Analys av cellssvar av Immunoblotting
- Kör lysates (från steg 3.1.3 eller 3.2.4) på en 4-15% Tris-HCl polyakrylamidgel, överföra till en polyvinylidene fluor membran, block och immunoblot med phospho-PKC Ζ Thr410 (för att upptäcka phospho-PKBR1 och phospho-PKBA). Detektera signalen genom inkubation med pepparrot peroxidaskonjugerat anti-kanin sekundär antikropp, följt av chemiluminescence använder förbättrad chemiluminescence substrat.
- För påvisande av flera proteiner, remsa blot med stripp buffert och åter sond med en primär antikropp mot phospho-p42/44 MAPK Thr302/304 (för att upptäcka phospho-ERK2). Bekräfta lika protein lastning av färgning polyvinylidene fluor membranet med Coomassie Brilliant Blue.
4. Akut mekanisk stimulering och Live Imaging av enstaka celler på mikroskopet
- bedömning av svar till akut mekanisk stimulering använder en flöde enhet
- samla och späd vegetativt eller aggregering-behöriga celler till ~ 1 x 10 6 celler/mL i DB enligt beskrivningen i steg 2.1 och 2.2, respektive. Läsa in ~ 600 µL i bilden med en kanal (se Tabell av Material för detaljer). Tillåta celler att fästa för 10 min. se till att alla vikar i bilden är helt fyllda. Toppa upp med extra buffert vid behov.
Obs: Viss bilden används för analys har tre ingångar, som matas in smala, 1 mm kanaler, men sedan sammanfoga till en bred, 3 mm kanal. Höjden på kanalen är 0,4 mm. Även om cellerna är klädd i hela kanalen, endast den breda delen är avbildade. - Passerar en av de linjer som är kopplad till en 50 mL behållare genom den främre rätt ventilen av fluidic enheten (se Tabell av material för detaljer). Att använda programvaran för pumpen, kontrollera att ventilen är stängd (dvs till vänster). Fyll behållaren med DB.
- Ställ in trycket vid 50 mbar och slå på den. Fylla och skölj raden med DB genom att klicka på ventilen att öppna den. Slå på trycket tillbaka till 0, och Stäng ventilen efter ~ 30 s.
- Ansluter linjen till en av de tre vikar på ena sidan av bilden utan svällning eventuella luftbubblor. Anslut de andra två vikar. Anslut linjen från avloppet till den enda öppningen på andra sidan av bilden.
Obs: Slangen används för inmatning och avlopp rader i denna inställning har en innerdiameter på 1,6 mm. - Placera bilden på mikroskopet under ett 20 X air-objektiv. För att skölja kanalen, byta ventilen öppna raden och klicka på " trycket på ", start vid högre tryck (~ 50 mbar eller ~ 40 dyn/cm 2) för att genomdriva vätskan till avloppet.
- När vätskan kommer ut i avloppet, minska externa påtryckningar till noll (dvs. gravitation flöde endast ~ 15 dyn/cm 2), och Fortsätt skölja för ~ 30 s. Switch ventilen till den motsatta ståndpunkten att stoppa flödet.
- Hämta bilder med RFP eller GFP belysning på en inverterad fluorescens Mikroskop under en 40 X olja mål 3 s mellanrum. Med ventilen i stängt läge, aktivera trycket på önskat tryck, normalt mellan 15 och 40 dyn/cm 2 (0 - 50 mbar).
- Efter att förvärva 5 ramar, leverera stimulansen genom att byta ventilen till den " öppna " position. Stänga flödet av efter 2-5 s genom att stänga ventilen i motsatt riktning.
Obs: För vissa svagare biosensorer (e.g. PTEN, CynA och RalGDS) det kan vara nödvändigt att bildceller med confocal Mikroskop utrustat med en 40 X olja mål.
- samla och späd vegetativt eller aggregering-behöriga celler till ~ 1 x 10 6 celler/mL i DB enligt beskrivningen i steg 2.1 och 2.2, respektive. Läsa in ~ 600 µL i bilden med en kanal (se Tabell av Material för detaljer). Tillåta celler att fästa för 10 min. se till att alla vikar i bilden är helt fyllda. Toppa upp med extra buffert vid behov.
- Testa effekterna av farmakologiska hämmare på akut mekanisk stimulering använder en flöde enhet
- platta celler i bilden med en kanal som beskrivs i steg 4.1.1. Ställa in två linjer: passera en linje genom den främre rätt ventilen som i steg 4.1.2, och andra genom baksidan lämnade valve. Klämma den vänstra linjen och sätta ventilen i den " stängda " (vänster). Fyll en rad med DB som innehåller lämpliga fordonet och andra med lösningen innehållande en farmakologiska hämmare av intresse (t.ex. 5 µM Latrunculin A).
Obs: Det är nödvändigt att fysiskt klämma den vänstra raden eftersom den " stängda " vänster position öppnas ventilen för raden. - Fyllning och skölj rätt linje genom att aktivera trycket vid 50 mbar och byta ventilen till den " öppna " (höger) position. Byta ventilen till vänster efter ~ 30 s. fyllning och skölj vänstra raden genom att ta bort klämman för ~ 30 s. Anslut båda linjerna till två av vikar på ena sidan av bilden med en kanal, Anslut det återstående inloppet och ansluta avloppet till den enda öppningen på den andra sidan. < / l Jag >
- tvätta bilden med bufferten i rätt linje och utför stimulering i samma bufferten som beskrivs i steg 4.1.3 och 4.1.4 ovan.
Obs: Rätt linje valdes som den första i denna setup, ordningen kunde omvändas. - Efter stimulering, byta ventilen för att öppna rätt linje vid noll tryck (dvs gravitation flöde endast, ~ 15 dyn/cm 2). Ta bort klämman från vänstra linjen och byta ventilen till vänster för att öppna den linjen. Klämma den första raden.
- Efter 3-5 mL buffert med hämmare genom ska byta ventilen till höger för att stoppa flödet, och inkubera cellerna med hämmaren för önskad längd av tid (t.ex. 15 min). Aktivera flödet genom att byta ventilen varje ~ 10 min för ~ 15 s för att undvika syrebrist. Upprepa stimulering med den andra raden.
- platta celler i bilden med en kanal som beskrivs i steg 4.1.1. Ställa in två linjer: passera en linje genom den främre rätt ventilen som i steg 4.1.2, och andra genom baksidan lämnade valve. Klämma den vänstra linjen och sätta ventilen i den " stängda " (vänster). Fyll en rad med DB som innehåller lämpliga fordonet och andra med lösningen innehållande en farmakologiska hämmare av intresse (t.ex. 5 µM Latrunculin A).
- Alternativ metod att bedöma svar på akut mekanisk stimulering med hjälp av en mikropipett
- inrätta en mikropipett fylld med DB enligt standardprotokoll 23. Hålla ersättning trycket vid 1500 psi.
- Samla och späd vegetativa celler som beskrivs i steg 2.1. Plats 25 µL droppar ~7.5 x 10 5 celler/mL i en 1-väl kammare, tillåta att följa i minst 10 min, och täck med 3 mL DB.
- Placera kammaren på en inverterad fluorescens Mikroskop utrustat med ett 40 X-objektiv för olja. Hitta cellerna. Försiktigt sänka mikropipett i mitten av synfältet tills det först når botten av kammaren.
Obs: Eftersom ersättning trycket var inställd på 1 500 Psi, cellerna kontinuerligt exponeras för ett långsamt flöde av DB från mikropipett. - Börjar förvärva bilder med RFP eller GFP belysning 3 s mellanrum. Tillämpa den ' rena ' funktion att släppa en bolusdos av vätskan från mikropipett. Fortsätt imaging jagn förekomsten av kassaflödet på grund av ersättning trycket ensam.
- En alternativ metod att bedöma svar på akut mekanisk stimulering använder bulk buffert tillägg
- samla och späd vegetativa celler som beskrivs i steg 2.1. Placera 20 µL droppar celler på ~ 1 x 10 6 celler/mL i DB i mitten en brunn från en 8-väl kammare. Tillåta celler att följa i minst 10 min.
- Börjar förvärva bilder med RFP - eller GFP-specifika belysning på en inverterad fluorescens Mikroskop utrustat med ett 40 X-objektiv med 3 s mellanrum. Fokusera på ett område nära kanten på nedrullningsbara.
- Tillsätt snabbt 430 µL DB i ena sidan av brunnen. Fortsätt imaging.
- För analys av samspelet mellan mekaniska och kemiska stimuli, 12 eller 45 s mekanisk stimulering, varsamt Tillsätt 50 μl av folsyra (slutlig koncentration 20 nM) eller fordon (DB) utan att förmå en mekanisk svar. Fortsätt imaging.
- Kvantifiering av svar
- Öppna i 32-bitars TIFF-bild i bild analys programvara (se Tabell av material för detaljer) 27.
- Under den ' analysera ' fliken, gå till " ange mätningar ". Markera kryssrutan för ' menar grå värdet '. Se de andra rutorna inte kontrolleras. Klicka på " OK ".
- Under den ' processen ' tab, klick " subtrahera bakgrunden ". Hålla den rullande boll radien på 50 pixlar, och gör inte check någon av alternativen visas i menyn. Zooma in på en cell som använder den ' förstoringsglas ' verktyget.
- Med den ' rektangeln ' verktyg, rita en ruta (~2.5 x 2,5 µm 2) i cytosolen, se till att inte dra den över kärnan eller plasmamembranet. Tryck på " Ctrl " + " M " nycklar eller gå till den ' analysera ' fliken och klicka på " åtgärd " att bestämma grå medelvärdet av rutan. Avancemang till efterföljande bildrutor och mäta igen, att se till att rutan stannar i cytosolen.
Obs: Eftersom D. discoideum celler flytta mycket snabbt rutan kan flyttas från en frame till nästa att hålla det i cytosolen. - Efter alla bildrutor har analyserats, Kopiera värdena till ett kalkylblad. För att beakta cell till cell variation i uttrycksnivåerna av olika biosensorer, normalisera värdena för medelvärdet grå observerades vid tiden 0. Beräkna det reciproka värdet av värdena att återspegla ansamling av signalen på cortex.
5. Kontinuerlig mekanisk stimulering och Live Imaging av enstaka celler på mikroskopet
- ställa in cellerna exakt som beskrivs ovan för akut mekanisk stimulering analys i steg 4.1.1 - 4.1.3. Öppna kontakten som täcker dammen med bufferten så volymen kan toppas om svar analyseras längre än några minuter i taget.
Obs: Eftersom reservoaren förblir öppen för varaktigheten av experimentet, denna analys utförs i avsaknad av yttre tryck och bygger på gravitation flöde ensam. För att öka flödet av gravitationen, avloppet kan placeras på ett bord under mikroskopet. - Börjar imaging celler med RFP - eller GFP-specifika belysning på en inverterad fluorescens Mikroskop utrustat med ett 40 X-objektiv med 3 s intervall för analys av biosensor svaren. Alternativt, bild med faskontrast använder ett 20 X-objektiv med 10 s intervall för analys av övergripande cellmigration.
- Aktivera flödet efter flera bildrutor på inställningen noll-tryck (dvs. flödet beror på gravitation ensam eller ~ 15 dyn/cm 2) genom att stänga ventilen i öppet läge. När vätska sjunker till 5-10 mL i reservoaren, fyll upp med mer buffert. Se till att lägga till vätskan noggrant så att luftbubblor inte fastna i raderna.
Obs: Det är viktigt att lägga till vätska av samma temperatur att undvika ett chock svar i cellerna. - Kvantifiera cell hastighet och uthållighet med migration analysprogramvara (se Tabell av material för detaljer) enligt tillverkaren ' anvisningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Temporal svar av chemotaxisna regulatorer till akut mekanisk stimulering
För att bedöma D. discoideum celler reagerar på mekanisk stimulering, utsattes vidhäftande aggregation-kompetenta celler för en kort puls av skjuvning flöde. Sammanläggning-behöriga D. discoideum celler utsöndrar cAMP, som kan förnimmas av närliggande celler. För att övervinna bidrag cell cell signalering, behandlades celler med koffein, som hämmar viktreglerande cyclase i D. discoideum och således förhindrar cAMP sekretion28. Faktiskt celler förbehandlade med koffein hade mycket låg basal aktivitet av PKBR1 och ERK2 och uppvisade en stabil ökning fosforyleringen av viktiga rester av dessa kinaser 5 s stimulering med skeva flöde (figur 1A). Svaret var övergående och nådde en topp runt 10-15 s för PKBR1, och runt 30 s för ERK2, likaså att tidigare publicerade resultat för aktivering av dessa proteiner med en korrektiv7.
Även om det är svårt att bedöma effektiviteten av svar med tanke på den låga basala nivån, förstudier som ledde till utvecklingen av denna analys, jämfört stimulering med skeva flöde ensam (eller med ett fordon) till shear flöde i närvaro av en Chemoattractant cAMP (figur 1B). Denna analys visade en ökning i svar med lägret, vilket tyder på att svaret från signaltransduktion nätverket vill skeva flöde är mättad. Även i denna analys cAMP inte ökade fosforylering av PKBR1, kan cellernas svar på korrektiv observeras med en standard stimulering protokollet där aggregation-kompetenta celler hålls i suspension, stimuleras med cAMP och lyserat vid olika tidpunkter efter stimulering. Som visas i figur 1 c, under dessa förhållanden finns det en övergående förhöjning av PKBR1 fosforylering i svar på korrektiv, men inte fordonet. Den maximala belastningen observeras 30 s i denna analys eftersom temperaturen av cellsuspensionen under analysen är ~ 9 ° C, jämfört med ~ 22 ° C för mekanisk stimulering analys beskrivs ovan26.
Spatiotemporal svar av ledande och släpar kanten markörer till akut mekanisk stimulering
Eftersom befolkningen analysen ovan ger endast temporal information om beteendet för chemotaxis regleringsmyndigheter, utsattes också celler för en kort mekanisk stimulering samtidigt som observerats med ett mikroskop. Denna analys kan utföras antingen med aggregation-behöriga eller vegetativt D. discoideum celler som uttrycker olika fluorescently-märkt biosensorer vars lokalisering definierades i celler stimuleras med en korrektiv. Två ledande markörer, PH domän av Crac och LimEΔcoil, som rekryteras av PIP3 eller nyligen polymeriseras aktin, visade båda mestadels cytosoliska lokalisering i vilande celler som tidigare rapporterats (figur 2A, kompletterande film 1 )4,29. I celler som var basally aktiva, kunde dessa biosensorer också ses på tips av pseudopods. Efter stimulering med skeva flöde för 2 s, de biosensorer som snabbt relocalized till hjärnbarken med en peak på ~ 6 till 10 s, och återvände till cytosolen av ~ 30 s. Däremot lokaliserade en eftersläpande kanten markör PTEN på cortex innan stimulering (figur 2A). Efter en kort puls med skeva flöde, cytosoliska PTEN intensitet ökat, om än med långsammare dynamics än för de ledande biosensorer. En förändring i biosensor localization från cytosolen syns cortex, och vice versa, tydligt som en förändring i cytosoliskt intensitet möjliggör enkel kvantifiering av svaret.
Observerade beteendet hos biosensorer som svar på akut mekanisk stimulering är förenligt med ledande och släpar kanten lokalisering dynamics som svar på stimulering med enhetliga korrektiv. Problemet var inte unikt för de tre biosensorer som visas. Som tidigare publicerade, liknande förändringar i lokaliseringen observerades också för framkant markörer RBD och RalGDS, aktiveras som känner igen Ras- och Rap1, respektive, liksom när det gäller en annan eftersläpande kanten markör CynA22,30.
En liknande analys kan användas för att bedöma effekterna av olika hämmare av en enkel modifiering av experimentella inställningarna från en enda ingång rad till en dubbel. Med den här metoden kan cellerna först exponeras till villkor kontroll, och sedan bytte till den buffert som innehåller de önskade test-agenten. Till exempel tillägg av aktin-depolymerizing drog LatA blockerade svaret av RBD samt LimEΔcoil, akut mekanisk stimulering (figur 2B).
Global respons föregår cellmigration under långvarig stimulering med skeva flöde
Den metod som beskrivs här kan också anpassas att studera effekter av skjuvning flöde på D. discoideum migration. I själva verket, om flödet inte var avstängd efter 2 s men låg kvar på under experimentet, vegetativa celler visade regisserad migration mot strömmen (figur 3kompletterande Movie 2). Det bör noteras att den skjuvning flöden nödvändigt att framkalla en flyttande reaktion var lägre än trycket som vanligtvis används för att uppnå en global respons med akut stimulering i vegetativa celler (till exempel, som kan ses i figur 2B). Men även vid lägre tryck visas celler en robust enhetligt svar, mätt som en förändring i LimEΔcoil lokalisering, som föregick någon förändring i cellen själv. Således visade dessa experiment tydligt att 1) den globala Svaren beror inte på förflyttning av cellen, och (2) den globala Svaren föregår riktad migration.
Alternativa metoder för testning akut mekanisk stimulering
Även om användningen av en genomströmmande kammare har klara fördelar för studien av svar till akut mekanisk stimulering, validerade vi också två ytterligare analyser för att testa enskilda celler reagerar på akut mekanisk stimulering. I figur 4visas LimEΔcoil snabbt och övergående åter lokaliserade från cytosolen cortex när cellerna stimuleras av bolus tillägg av buffert levereras antingen av en mikropipett (figur 4A) eller manuellt med hjälp av bulk buffert tillägg med en pipett (figur 4B). Det bör noteras att en klar nackdel för båda av dessa analyser är att den exakta mängden tvärkraften som levereras till cellen är okänd och kan inte varieras enkelt. Men för situationer där växling mellan mekaniska och kemiska stimuli önskas, erbjuder bulk buffert tillägg en solid alternativ till stimulering i flödet enheten.
Figur 1: representativa resultat för biokemiska bedömning av svaret från D. discoideum celler till akut mekanisk eller kemisk stimulering. Sammanläggning-kompetenta celler utsattes för mekaniska eller kemiska stimuli, lyserat vid angivna tidpunkter, och immunoblotted med antikroppar som känner igen fosforyleras PKBR1 eller ERK2. (A) anhängare celler stimuleras i orbitalskak för 5 s. Membranet var målat med Coomassie Brilliant Blue (CBB) att visa lika protein lastning. (B) anhängare celler stimuleras av manuell förflyttning av plattan på ett kors sätt för ungefär 5 s efter kemisk stimulering på grund av tillägg 1 µM cAMP eller buffert (fordon), eller utan någon kemisk stimulering (-). De två immunoblots visar omfattningen av variation i basal aktivering av PKBR1 sett vid tidpunkt 0. Ibland kunde PKBA aktiveringen också ha upptäckts av denna teknik, som visas i den nedre panelen. (C) Suspension celler stimuleras med 1 µM cAMP eller buffert (fordon). Del A av denna siffra har ändrats från Artemenko et al. (2016) 22. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa resultat för akut mekanisk stimulering och levande avbildning av enstaka celler på mikroskopet. (A) Aggregation-behöriga D. discoideum celler uttrycker RFP-taggade LimEΔcoil, eller GFP-märkta PH-Crac eller PTEN stimuleras med enkelriktad laminärt flöde på 15 dyn/cm2 för 2-5 s. bilderna var samlas varje 3 s . Representativa celler visar flyttning av biosensorer som svar på mekanisk stimulering visas. Ansamling av varje biosensor på cortex kvantifierades som inversen av genomsnittlig cytoplasmiska intensiteten normalisering för tid 0. Det genomsnittliga svaret från 18 (LimEΔcoil), 20 (PH-Crac) eller 6 (PT) celler visas. Värden är menar ± SE. (B) vegetativa celler som uttrycker RFP-taggade LimEΔcoil- RFP och GFP-märkta RBD behandlades med fordon eller 5 µM LatA för minst 15 min, och sedan stimuleras med enkelriktad laminärt flöde på 41 dyn/cm2 för 2 s. bilder samlades varje 3 s. RBD-GFP och LimEΔcoil- RFP ackumulering vid cortex kvantifierades som i (A). Värden är medelvärde ± SE. Antalet celler som analyseras är anges bredvid varje villkor. Skalstapeln = 10 µm. Denna siffra har ändrats från Artemenko o.a. (2016) 22. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativa resultat för svaret från D. discoideum celler till långvarig stimulering med flöde. (A) vegetativa celler som uttrycker RFP-taggade LimEΔcoil utsattes för kontinuerlig enkelriktad laminärt flöde på 15 dyn/cm2 och avbildas varje 3 s. spår 11 celler visas i (B). Skalstapeln = 10 µm. Denna siffra har ändrats från Artemenko o.a. (2016) 22. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa resultat för alternativa metoder att testa akut mekanisk stimulering. (A) vegetativt D. discoideum celler uttrycker RFP-taggade LimEΔcoil utsattes för en mikropipett (*) basally släppa analysbuffert i långsam takt. En kort ökning av flödet klassar uppnåddes genom snabb leverans av en bolusdos på analysbuffert vid tidpunkt 0. Bilder samlades varje 3 s. (B) vegetativt D. discoideum celler som uttrycker RFP-taggade LimEΔcoil klädd som en liten droppe i en mikroskopi kammare mekaniskt stimuleras genom tillsats av en stor volym buffert till den kammaren. Bilder samlades varje 3 s. skala bar = 10 µm. del (A) i denna siffra har ändrats från Artemenko o.a. (2016) 22. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Kompletterande film 1: Akut mekanisk stimulering utlöser snabb och tillfällig flyttning av LimEΔcoil- RFP eller PH-Crac-GFP från cytosolen cortex i aggregering-behöriga D. discoideum celler uttrycker dessa biosensorer. Enkelriktad laminärt flöde var påslagen för 5 s vid tidpunkt 0 och celler var avbildade 3 s mellanrum. Uppspelningshastigheten är 5 bildrutor/s. Två exempel för varje cellinje visas. Skalstapeln = 10 µm. Denna film motsvarar figur 2A och har ändrats från Artemenko o.a. (2016) 22. vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande film 2: Kontinuerlig mekanisk stimulering utlöser snabb och tillfällig flyttning av LimEΔcoil- RFP från cytosolen cortex före migrering av celler mot riktningen av flödet. Vegetativa celler som uttrycker LimEΔcoilvar - RFP utsatta för kontinuerlig skjuvspänning 15 dyn/cm2 börjar på tid 0 och avbildas 3 s mellanrum. Uppspelningshastigheten är 10 ramar/s. skala bar = 10 µm. Denna film motsvarar siffran 3 och tidigare har publicerats i Artemenko o.a. (2016) 22. vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoderna som beskrivs här erbjuda ett bekvämt sätt att bedöma både befolkningen och enskild cell beteende som svar om du vill skeva flöde. Viktigare, medan tidigare studier analyseras lokalisering av leder och släpar kanten markörer under migreringen, tillåter den nuvarande strategin utredning av omedelbara effekter genom att tillämpa skjuvning flödet akut. Med den här metoden visat vi att, i själva verket det första svaret av celler till shear flöde inte kräver cellmigration. I stället föregår den snabba och övergående svaren på inledande skjuvning flöde stimulans riktad migreringen sett med långvarig exponering till shear flöde, på samma sätt som den första globala svar sett med korrektiv lutning.
De biokemiska och mikroskopiska metoderna ge kompletterande data även om varje metod har distinkta fördelar och nackdelar. Stimulering följt av cell lysis och immunoblotting PKBs, KrsB och ERK, exempelvis analyserar en hel population av celler och därmed genomsnitt cell till cell variation, till skillnad från ett test som undersöker enskild cell beteende. Populationsbaserade analyser tenderar dock att mask subtila förändringar i cell beteende som enkelt kan observeras genom att analysera enskilda celler. Dessutom, är biokemiska analysen beskrivs här endast effektivt med aggregation-kompetenta celler, av skäl som kommer att diskuteras senare. Däremot mikroskopi-baserade analysen av relocalization av RBD, RalGDS, PH-Crac, LimEΔcoiloch PTEN, exempelvis mellan cortex och cytosol är effektiv för både vegetativ och aggregation-kompetenta celler, och därmed möjliggör observationer som är allmänt tillämpliga på celler med varierande grad av polarisering. Vad gör de två synsätten kompletterande är det faktum att de undersöker olika uppsättningar tillgängliga ledande/släpar kanten markörer, således utöka täckningen av de signal transduktion och aktin cytoskelettet nätverk testade med skeva flow-analys.
Det är fortfarande oklart varför vegetativa celler, som svara mycket kraftfullt mikroskopi-baserade analyser, inte svarar på stimulering följt av cell lysis och immunoblotting. En möjlighet är att mängden tvärkraften som tillämpas på celler när tallriken roterar inte matchar den kraft som upplevs av cellerna i en flöde kammare. Utvecklade celler, däremot kan ha en lägre tröskel för aktiveringen, och således svara antingen villkor. Det är osannolikt att de biosensorer vars verksamhet mäts genom biokemiska analysen uttrycks inte eller är inte aktiverat i vegetativa celler, eftersom stimulering av vegetativa celler med folsyra leder till robust aktivering av både PKBR1/PKBA och ERK2 (data inte visas). Vegetativa celler visar dessutom tydligt rekrytering av PH-Crac, som avspeglar PIP3 ackumulering, i mikroskopi-baserad analys. Eftersom PKBA rekrytering beror också på PIP3, verkar det osannolikt att PKBA inte skulle svara till akut mekanisk stimulering, såvida inte villkoren i biokemiska analysen inte är optimal som nämnts ovan. Detta är fortfarande ett område med aktiv utredning.
Den biokemiska analysen av chemotaxisna tillsynsmyndigheter krävs närvaro av koffein i hela experimentet. Ursprungligen lades koffein för att förhindra cell till cell signalering på grund av sekretion av lägret. Det verkar dock att koffein har en annan roll förutom hämning av viktreglerande cyclase (ACA) eftersom ACA-null celler krävs fortfarande koffein för fosforylering av PKBR1 svar på akut mekanisk stimulering. Koffein har tidigare visat att blockera TorC2 aktivitet26. Det är möjligt att hämning av TorC2 blockeras vissa basala motilitet av cellerna, och därmed sänkt basal aktivering av PKBR1 och andra komponenter i signal transduktion och aktin cytoskelettet nätverk. Låg basal aktivitet var absolut nödvändigt för att Observera att bemöta skeva flöde. När celler samlades vid tidigare tidpunkter under utveckling, visas de i själva verket ökad basal aktivitet och minskad skjuvning-flöde inducerad respons. Intressant, är det känt att vegetativa celler har proportionellt mer PKBA aktivitet och mindre PKBR1 jämfört med utvecklade celler31. Det är möjligt att den basala staten regleras något olikt i vegetativt och aggregation-kompetenta celler, ytterligare bidrar till bristen på ett svar av vegetativa celler i biokemisk analys. Nyfiket, när celler samlades in vid senare tidpunkter för utveckling, de hade också en minskad reaktion, sannolikt på grund av den starka påverkan av polaritet på lokaliseringen och aktivering av olika chemotaxis tillsynsmyndigheter granskade i denna analys.
Stimulering av celler i en mikroskopi kammare avslöjade att både styrkan och varaktigheten av stimulans bidrar till maximalt svar22. Med andra ord, ett maximalt svar kan uppnås även med en låg tvärkraft om den används under en längre tid (10 s kontra 2 s). Denna observation förklarar varför celler har ett första globala svar när de först utsätts för en kontinuerlig, men svag, stimulans som leder till skeva flöde-inducerad migration. Med den aktuella apparaten gick det inte att generera tillräckligt låg skjuvning flöde för att undersöka den nedre änden av intervallet.
Kanske är den viktigaste innebörden av de studier som genomförts med hjälp av akut mekanisk stimulering att både mekaniska och kemiska stimuli verkar bidra till gemensamma signaltransduktion och aktin cytoskelettet nätverk. Även om vi visade att de två stimuli integrerar med bulk buffert tillägg för mekanisk stimulering, syftar framtida studier till att utveckla ett system där korrektiv kan levereras snabbt i kanalen genomflöde, vilket skulle vara en mycket mer mångsidig och kraftfullt sätt att bedöma integration av mekaniska och kemiska stimuli. Tyvärr är korrektiv tillägg med nuvarande två-line setup associerade med en andra skjuvning flöde stimulans eftersom korrektiv måste levereras i närvaro av flöde. Ett alternativ kan vara laser-stimulerad frisättning av en korrektiv från en bur föregångare som visades framgångsrikt för cAMP av Westendorf et al. 32. i framtiden, skulle det också vara intressant att undersöka integreringen av andra stimuli, exempelvis skeva flöde och varierande elektriska fält eller skeva flöde och variabel substrat stelhet. Det sistnämnda exemplet är intressant eftersom det handlar om två typer av mekanisk stimulering, även om den inledande Signalmottagningen kan skilja sig mellan dem. Bekräftar att alla stimuli som inducerar riktad migration delar samma signaltransduktion nätverk och varierar endast i hur stimulus uppfattas kommer att förklara hur celler kan navigera i komplexa miljöer. Slutligen har vi redan visat att akut stimulering med skeva flöde leder till spridning av humana neutrofiler-liknande celler22. Framtida arbete kommer att vidare undersöka lokalisering och aktivering av olika komponenter av de signal transduktion och aktin cytoskelettet nätverk med mekaniska stimuli i däggdjursceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av National Institutes of Health grant R35 GM118177 till PND.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Dextrose | Fisher | D16-1 | Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2) |
| Proteose peptone | Fisher | DF0120-17-6 | Use to prepare HL-5 media (step 1.1) |
| Yeast extract | Fisher | 50-550-445 | Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2) |
| Na2HPO4·7H2O | Fisher | S373-500 | Use to prepare HL-5 media, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1, 1.3) |
| KH2PO4 | Fisher | P386-500 | Use to prepare HL-5 media, SM plates, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1-1.3) |
| Streptomycin (dihydrostreptomycin sulfate) | Fisher | ICN10040525 | Use to prepare HL-5 media (step 1.1) |
| Peptone (Bacto) | Fisher | DF0118-17-0 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| K2HPO4 | Fisher | P288-100 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| MgSO4 | Fisher | M65-500 | Use to prepare DB Buffer (step 1.4) |
| CaCl2 | Fisher | C79-500 | Use to prepare DB Buffer (step 1.4) |
| Caffeine | Fisher | O1728-500 | Use to prepare caffeine (step 1.5) |
| cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt) | Fisher | 11-680-1100MG | Use to prepare cAMP (step 1.6) |
| Folic acid | Sigma | F7876 | Use to prepare folic acid (step 1.7) |
| Tris base | Fisher | BP152-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 1610610 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | 1610404 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| NaF | Fisher | S299-100 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Na3VO4 | Fisher | 50-994-911 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Fisher | S390-500 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) | Sigma | 11873580001 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Latrunculin A | Enzo Life Sciences | BML-T119-0100 | Use to prepare Latrunculin A (step 1.9) |
| 4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel | Bio-Rad | 3450029 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Polyvinylidene fluoride membrane | Bio-Rad | 1620177 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit antibody | Cell Signaling | 2060 | Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antibody | Cell Signaling | 4370 | Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
| Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (from Donkey) | GE Healthcare | NA934-100UL | Secondary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
| Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate) | Bio-Rad | 1705060 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer) | Pierce | PI46430 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Coomassie Brilliant Blue | Fisher | PI20278 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| K. aerogenes strain (non-pathogenic) | Dicty Stock Center (dictybase.org) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials and Equipment | |||
| Orbital shaker (model G-33, or a comparable alternative) | New Brunswick Scientific | Use to grow K. aerogenes (step 2.1.1), and to basalate and stimulate D. discoideum cells (step 3). The radius of gyration for this shaker is 9.5 mm. | |
| 10 cm Petri dish | Fisher | FB0875712 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-51B | Use to count D. discoideum cells (step 2.1.2) |
| 35 mm dish (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish) | Fisher | 08-772A | Use to plate D. discoideumcells for mechanical stimulation followed by cell lysis (step 3.1.1) |
| Polystyrene cup (5 mL) | VWR | 13915-985 | Use to stimulate D. discoideum cell suspension with a chemoattractant (step 3.2.2) |
| Fluidic unit with pump (ibidi Pump System) | Ibidi | 10902 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5) |
| Slide with a channel (μ-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized) | Ibidi | 80316 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a fluidic device (steps 4.1, 4.2, and 5) |
| 50 mL reservoirs (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit) | Ibidi | 10978 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5) |
| Lines for the fluidic unit (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN) | Ibidi | 10964 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). Note: the two lines can also be cut from the 1.6 mm tubing (catalog number 10842). |
| Line for the drain (1.6 mm ID tubing) | Ibidi | 10842 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). |
| Zeiss Observer.Z1 inverted microscope equipped with a 40X/1.3 oil objective and a 20X/0.3 air objective (or a comparable alternative) | Zeiss | Used to image D. discoideum cells with phase-contrast or fluorescence illumination (steps 4 and 5) | |
| UltraView spinning disk confocal microscope equipped with a 40×/1.25–0.75 oil objective (or a comparable alternative) | Perkin-Elmer | DM 16000 | An alternative used to image D. discoideum cells (step 4.1.4) |
| FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247, or a comparable alternative) with Eppendorf InjectMan | Eppendorf | 5252000021D and 5192000027 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3). Note: catalog number are for the newest version of the equipment (4i). |
| Micropipette (Femtotip; 1 μm outside diameter, 0.5 μm inside diameter ) | Eppendorf | 930000035 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3) |
| Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector) | Eppendorf | 5242956.003 | Use to fill the micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1) |
| 1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) | Fisher | 12-565-472 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a micropipette (step 4.3.2) |
| 8-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass) | Fisher | 12-565-338 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by bulk buffer addition (step 4.4.1) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Image Analysis Software (Fiji) | NIH | https://fiji.sc/ | Use to quantify response to mechanical stimulation (step 4.5) |
| Migration analysis software (Tracking Tool PRO) | Gradientech | http://gradientech.se/tracking-tool-pro/ | Use to quantify cell speed and persistence (step 5.4) |
References
- Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity. Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).
- Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).
- Jeon, T. J., Lee, D. -J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II. J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).
- Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells. Cell. 95 (1), 81-91 (1998).
- Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis. Cell. 109 (5), 611-623 (2002).
- Iijima, M., Devreotes, P. Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients. Cell. 109 (5), 599-610 (2002).
- Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation. EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).
- Kamimura, Y., et al. PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis. Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).
- Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis. Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).
- Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration. Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).
- Nishikawa, M., Hörning, M., Ueda, M., Shibata, T. Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis. Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).
- Gerisch, G., et al. Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization. Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).
- Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system. BMC Cell Biol. 12 (1), 42 (2011).
- Bretschneider, T., et al. The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization. Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).
- Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility. PLOS Biol. 5 (9), e221 (2007).
- Devreotes, P., Horwitz, A. R. Signaling Networks that Regulate Cell Migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).
- Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes. Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).
- Dalous, J., et al. Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation. Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).
- Sato, M. J., et al. Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).
- Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field. Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).
- Decave, E., et al. Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate. J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).
- Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).
- Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants. Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).
- Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA. Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).
- Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. PIP3-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis. J Cell Biol. 204 (4), 497-505 (2014).
- Cai, H., Huang, C. H., Devreotes, P. N., Iijima, M. Analysis of chemotaxis in Dictyostelium. Methods Mol Biol. 757, 451-468 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
- Brenner, M., Thoms, S. D. Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum. Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).
- Bretschneider, T., et al. Dynamic Actin Patterns and Arp2/3 Assembly at the Substrate-Attached Surface of Motile Cells. Curr Biol. 14 (1), 1-10 (2004).
- Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).
- Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium. Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).
- Westendorf, C., et al. Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).
