megakaryocytes की एक अत्यंत शुद्ध जनसंख्या गर्भनाल रक्त व्युत्पंन CD34+ कोशिकाओं से प्राप्त किया जा सकता है । CD34+ कक्ष अलगाव और megakaryocyte विभेद के लिए एक विधि यहां बताई गई है ।
प्लेटलेट उत्पादन thrombopoiesis के रूप में जाना जाता प्रक्रिया में अस्थि मज्जा में मुख्य रूप से होता है । thrombopoiesis के दौरान, टेम जनक कोशिकाओं megakaryocytes बुलाया प्लेटलेट पुरोगामी, जो टर्मिनल लंबे cytoplasmic प्रक्रियाओं से प्लेटलेट्स जारी करने के लिए अंतर करने के लिए अलग प्लेटलेट्स कहा जाता है । Megakaryocytes दुर्लभ अस्थि मज्जा तक ही सीमित कोशिकाओं रहे है और इसलिए प्रयोगशाला उपयोग के लिए पर्याप्त संख्या में फसल के लिए मुश्किल है । मानव megakaryocytes के कुशल उत्पादन के लिए उपयुक्त परिस्थितियों के तहत संवर्धन CD34+ कोशिकाओं द्वारा इन विट्रो में प्राप्त किया जा सकता है । यहां विस्तृत प्रोटोकॉल गर्भनाल रक्त के नमूनों से छंटाई चुंबकीय कोशिका द्वारा CD34+ कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन करता है । सीरम मुक्त शर्तों के तहत अत्यधिक शुद्ध, परिपक्व megakaryocytes उत्पादन के लिए आवश्यक कदम बताए गए हैं । megakaryocyte विभेदन और प्लेटलेट के निर्माण के निर्धारण और प्लेटलेट उत्पादन के phenotypic विश्लेषण के विवरण भी प्रदान की जाती हैं । एंटी प्लेटलेट एंटीबॉडी या thrombopoietin mimetics के रूप में megakaryocyte विभेद और/या प्लेटलेट गठन, प्रभाव है कि प्रभाव, जैविक समारोह की जांच करने के लिए प्रसंस्कृत कोशिकाओं को जोड़ा जा सकता है ।
प्राथमिक मानव megakaryocytes (एमके) नियमित रूप से प्रयोगशाला के उपयोग के लिए पर्याप्त संख्या का अलगाव अस्थि मज्जा है, जहां वे nucleated कोशिकाओं के ~ ०.०१% के लिए खाते में उनके कम आवृत्ति के कारण व्यवहार्य नहीं है1। एक सुविधाजनक विकल्प है पूर्व vivo विस्तार और विशिष्ट विकास कारकों की उपस्थिति में टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं के भेदभाव । स्टेम सेल फैक्टर (एससीएफ, सी-किट ligand) और interleukin (il)-3 और आईएल-11 सहित साइटोकिंस की एक संख्या संस्कृति प्रणालियों में नियोजित किया गया है MKs उत्पादन । Thrombopoietin (टीपीओ) megakaryocytic संस्कृतियों के लिए सबसे प्रभावी विकास और भेदभाव कारक है और अकेले या अन्य साइटोकिंस, जैसे एससीएफ और IL-32के साथ प्रभावी है । टीपीओ स्टेम सेल आबादी पर कार्य करने के लिए दोनों प्रसार और MKs की परिपक्वता में परिणाम कर सकते है2।
एमके प्लेटलेट्स बुलाया cytoplasmic दखलंदाजी से प्लेटलेट्स का उत्पादन और, vivo में, लगभग 1 x 1011 प्लेटलेट्स १५० के प्लेटलेट काउंट्स को बनाए रखने के लिए दैनिक गठन कर रहे हैं-४०० x 109/L. प्लेटलेट उत्पादन इन विट्रो में १००० करने के लिए है – vivo में अनुमान3की तुलना में कम गुना, और इस विट्रो मेंएमके और प्लेटलेट उत्पादन में सुधार करने के लिए CD34+ टेम जनक कोशिकाओं का उपयोग कर कई संस्कृति की स्थिति को जन्म दिया है. CD34+ एमके भेदभाव के लिए इस्तेमाल कोशिकाओं के प्रारंभिक स्रोत मानव परिधीय रक्त4था । अंय सेल सूत्रों की अस्थि मज्जा5,6शामिल हैं, भ्रूण स्टेम कोशिकाओं/प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (ESC/iPSC)7, और गर्भनाल रक्त (यूसीबी)8,9,10 . मानव अस्थि मज्जा CD34+ 11 और माउस वंश नकारात्मक अस्थि मज्जा कोशिकाओं5 उत्पादन एमके और प्लेटलेट्स इन विट्रो में; फिर भी, मानव अस्थि मज्जा की उपलब्धता की कमी CD34+ कोशिकाओं के एक स्रोत के रूप में इसके उपयोग की सीमा. इसके विपरीत, ESC और iPSC इन विट्रो प्लेटलेट उत्पादन के लिए कोशिकाओं के एक असीमित स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं । इन कोशिकाओं से प्लेटलेट उत्पादन murine OP9 कोशिकाओं और लंबे समय तक संस्कृति अवधि के रूप में फीडर कोशिकाओं की आवश्यकता है । फीडर में ली गई प्लेटलेट्स-मुक्त स्थितियां कम कार्यात्मक12दिखाई देती हैं । iPSC-व्युत्पन्न प्लेटलेट्स नैदानिक सेटिंग्स में उपयोग के होने की संभावना है क्योंकि वे एक बड़े पैमाने पर विस्तारित किया जा सकता है । इस प्रक्रिया में प्रतिलेखन कारकों और दीर्घकालिक सेल संस्कृति13के lentiviral-मध्यस्थता transduction की आवश्यकता है ।
यूसीबी CD34+ कोशिकाओं है कि आसानी से अनुसंधान सेटिंग्स में इस्तेमाल किया जा सकता है की एक सुलभ स्रोत है । अकेले टीपीओ गर्भनाल रक्त-व्युत्पंन CD34+ कोशिकाओं के भेदभाव को बढ़ावा देने और इस सीरम पूरकता या सह फीडर कोशिकाओं के साथ संस्कृति के लिए आवश्यकता के बिना अत्यधिक शुद्ध, परिपक्व MKs को जंम देता है । अंय साइटोकिंस जैसे एससीएफ यूसीबी CD34+ कोशिकाओं से भेदभाव को कम कर सकते हैं, जबकि Flt-3 ligand और आईएल-11 अपरिपक्व megakaryocytes14के उत्पादन को बढ़ावा देते हैं । इस प्रोटोकॉल गर्भनाल रक्त CD34+ सीरम मुक्त स्थितियों में कोशिकाओं से अत्यधिक शुद्ध एमके संस्कृतियों के उत्पादन का वर्णन ।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल गर्भनाल रक्त से संस्कृति में मनोज और प्लेटलेट्स के लगातार उत्पादन के लिए उपयुक्त है । इन कोशिकाओं को एमके प्रसार, भेदभाव, प्लेटलेट गठन, और प्लेटलेट उत्पादन पर दवाओं या जैविक गतिव…
The authors have nothing to disclose.
लेखक ऑस्ट्रेलियाई स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (परियोजना अनुदान १०१२४०९ BHC से जुड़े) के समर्थन को स्वीकार करते हैं ।
Cell Culture Reagents | |||
Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | |
StemSpan SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | Serum-free media for CD34+ cells |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CD34 Isolation Reagents | |||
CD34 MicroBead kit ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | This kit includes the FcR human IgG blocking reagent and CD34 microbeads. These beads contain the anti-CD34 antibody clone QBEND/10. Use a different anti-CD34 clone for purity check (e.g. clone 8G12). |
Lymphoprep | Alere Technologies | 1114545 | Lymphocyte separation media (density 1.077 g/mL) |
Sterile separation buffer (SB) | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | This buffer contains phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA. It can be prepared using sterile, cell culture grade components. De-gas before use because air bubbles can block the column. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Flow Cytometry and Cell Staining Reagents | |||
PE Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 340669 | Clone 8G12. This can be used for CD34 purity check. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
PerCP mouse anti-human CD45 | BD Biosciences | 347464 | 1:10 dilution |
PerCP isotype control | BD Biosciences | 349044 | 1:10 dilution |
FITC Mouse anti-Human CD41a | BD Biosciences | 340929 | Final antibody concentration 1:5 dilution. |
APC Mouse anti-Human CD42b | BD Biosciences | 551061 | This antibody can also be used to detect mature MK (the percentage of positive cells in usually lower than with anti CD42a). Final antibody concentration 1:10 dilution. |
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a | AbD Serotec | MCA1227A647T | Currently distributed by Bio-Rad. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control | AbD Serotec | MCA928A647 | Currently distributed by Bio-Rad. Isotype control antibody |
Anti von Willebrand factor rabbit polyclonal | Abcam | AB6994 | 1:200 dilution |
V450 mouse anti-humna CD41a | BD Biosciences | 58425 | 1: 20 dilution |
V450 isotype control | BD Biosciences | 580373 | 1:20 dilution |
PAC1-FITC antibody | BD Biosciences | 340507 | 1:10 dilution |
Anti CD62p mouse monoclonal | Abcam | AB6632 | 1:200 dilution |
Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11008 | 1:100 dilution |
Alexa Fluor 594 goat anti mouse IgG | Invitrogen | A11020 | 1:100 dilution |
Ig Isotype Control cocktail-C | BD Biosciences | 558659 | Isotype control antibody |
Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
CountBright Absolute Counting Beads | Molecular Probes, Invitrogen | C36950 | Counting beads |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials | |||
LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Smaller and larger columns are also commercially available |
MidiMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
Falcon 5mL round bottom polypropylene FACS tubes, with Snap Cap, Sterile | In Vitro technologies | 352063 | |
Glass slides | Menzel-Glaser | J3800AMNZ | |
Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Inverted microscope | Leica | DMIRB inverted microscope | |
Fluorescent microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
Cell analyser | BD Biosciences | FACS Canto II | |
Cytospin centrifuge | ThermoScientific | Cytospin 4 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Cell analyser software | BD Biosciences | FACS Diva Software | |
Single cell analysis software | Tree Star | FlowJo | |
Fluorescent microscope software | Zeiss | Zen 2 blue edition |