Megakaryocyt differentiering och trombocytantal Formation från mänskliga sladd blod-derived CD34+ celler
Summary
En mycket ren population av megakaryocyter kan erhållas från sladd blod-derived CD34+ celler. En metod för CD34+ isolering och megakaryocyt celldifferentiering beskrivs här.
Abstract
Trombocytantal produktion uppstår huvudsakligen i benmärgen i en process som kallas thrombopoiesis. Under thrombopoiesis skilja hematopoetiska stamceller att bilda trombocyter prekursorer kallas megakaryocyter, som obotligt gör åtskillnad mellan för att släppa trombocyter från länge cytoplasmiska processer kallas proplatelets. Megakaryocyter är sällsynta celler begränsad till benmärgen och är därför svåra att skörda i tillräckligt antal för laboratoriebruk. Effektiv produktion av mänskliga megakaryocyter kan vara uppnådda i vitro genom odling CD34+ celler under lämpliga betingelser. Protokollet beskrivs här beskriver isolering av CD34+ celler av magnetiska cell sortering från navelsträngen blodprov. Nödvändiga åtgärder för att producera mycket ren, Mogen megakaryocyter serumfritt villkor beskrivs. Detaljer av fenotypiska analys av megakaryocyt differentiering och bestämning av proplatelet bildning och trombocytantal produktion finns också. Effektorer som påverkar megakaryocyt differentiering eller proplatelet bildande, såsom trombocythämmande antikroppar eller trombopoetin mimetika, kan läggas till odlade celler att undersöka biologisk funktion.
Introduction
Isolering av ett tillräckligt antal primära mänskliga megakaryocyter (MK) för regelbundna laboratoriebruk är inte möjlig på grund av deras låga frekvens i benmärgen, där de står för ~0.01% av kärnförsedda celler1. Ett bekvämt alternativ är ex vivo expansion och differentiering av hematopoetiska stamceller och stamceller i närvaro av specifika tillväxtfaktorer. Ett antal cytokiner inklusive stamceller faktor (SCF; c-kit-ligand) och interleukin (IL) -3 och IL-11 har varit är anställd i kultur system att producera MKs. Thrombopoietin (TPO) den mest effektiva tillväxt och differentiering faktorn för megakaryocytic kulturer och är effektiv ensam eller med andra cytokiner, såsom SCF och IL-32. TPO kan agera på stem cellpopulationer att resultera i både spridning och mognaden av MKs2.
MK produkter trombocyter från cytoplasmiska utbuktningar kallas proplatelets och, in vivo ca 1 x 1011 trombocyter är är bildas dagligen för att upprätthålla trombocytantal 150-400 x 109/l. trombocytantalet produktion i vitro upp till 1000 -Vik lägre än den i vivo uppskattar3, och detta har gett upphov till många kultur förhållanden med hjälp av CD34+ hematopoetiska progenitorceller att förbättra MK och trombocytantal produktion i vitro. Ursprungliga källan av CD34+ celler som används för MK differentiering var humant perifert blod4. Andra cell-källor är benmärgen5,6, embryonala stamceller/inducerade pluripotenta stamceller (ESC/iPSC)7och navelsträngen blod (UCB)8,9,10 . Mänsklig benmärg CD34+ 11 och mus härstamning negativa benmärg celler5 råvaror MK och trombocyter in vitro; Trots bristen på tillgänglighet av mänsklig benmärg begränsar dess användning som en källa av CD34+ celler. Däremot representerar ESC och iPSC en obegränsad källa av celler för in vitro- produktion av trombocyter. Trombocytantal produktionen från dessa celler kräver feeder celler murina OP9 och kultur längre. Trombocyter härrör i feeder-fria förhållanden verkar vara mindre funktionella12. iPSC-derived trombocyter är sannolikt att vara av användning i kliniska inställningar eftersom de kan utökas till stor skala. Denna process kräver lentiviral-medierad transduktion transkriptionsfaktorer och långsiktiga cell kultur13.
UCB är en lättillgänglig källa av CD34+ celler som lätt kan användas i forskning inställningar. TPO ensam kan främja differentiering av sladd blod-derived CD34+ celler och detta ger upphov till högt rena, Mogen MKs utan behov av serum tillskott eller samtidig kultur med feeder celler. Andra cytokiner såsom SCF kan minska differentiering från UCB CD34+ celler, medan Flt-3 ligand och IL-11 främja produktionen av omogna megakaryocyter14. Det här protokollet beskriver produktionen av högt rent MK kulturer från navelsträngsblod CD34+ celler i serumfritt villkor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet beskrivs här är lämplig för konsekvent produktion av MK och trombocyter i kultur från navelsträngsblod. Dessa celler kan användas för att studera olika processer såsom effekten av läkemedel eller biologiska aktiviteter på MK proliferation, differentiering, proplatelet bildning och trombocytantal produktion.
En mängd kultur media och cytokin kombinationer har presenterats i litteraturen. Tillägg av cytokiner såsom stamceller faktor, Flt-3 ligand, IL-3 och IL-6 stöder …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner stöd av australiska hälsa och medicinska forskningsrådet (projekt grant 1012409 kopplade till BHC).
Materials
| Cell Culture Reagents | |||
| Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | |
| StemSpan SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | Serum-free media for CD34+ cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 Isolation Reagents | |||
| CD34 MicroBead kit ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | This kit includes the FcR human IgG blocking reagent and CD34 microbeads. These beads contain the anti-CD34 antibody clone QBEND/10. Use a different anti-CD34 clone for purity check (e.g. clone 8G12). |
| Lymphoprep | Alere Technologies | 1114545 | Lymphocyte separation media (density 1.077 g/mL) |
| Sterile separation buffer (SB) | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | This buffer contains phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA. It can be prepared using sterile, cell culture grade components. De-gas before use because air bubbles can block the column. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry and Cell Staining Reagents | |||
| PE Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 340669 | Clone 8G12. This can be used for CD34 purity check. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| PerCP mouse anti-human CD45 | BD Biosciences | 347464 | 1:10 dilution |
| PerCP isotype control | BD Biosciences | 349044 | 1:10 dilution |
| FITC Mouse anti-Human CD41a | BD Biosciences | 340929 | Final antibody concentration 1:5 dilution. |
| APC Mouse anti-Human CD42b | BD Biosciences | 551061 | This antibody can also be used to detect mature MK (the percentage of positive cells in usually lower than with anti CD42a). Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a | AbD Serotec | MCA1227A647T | Currently distributed by Bio-Rad. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control | AbD Serotec | MCA928A647 | Currently distributed by Bio-Rad. Isotype control antibody |
| Anti von Willebrand factor rabbit polyclonal | Abcam | AB6994 | 1:200 dilution |
| V450 mouse anti-humna CD41a | BD Biosciences | 58425 | 1: 20 dilution |
| V450 isotype control | BD Biosciences | 580373 | 1:20 dilution |
| PAC1-FITC antibody | BD Biosciences | 340507 | 1:10 dilution |
| Anti CD62p mouse monoclonal | Abcam | AB6632 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11008 | 1:100 dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti mouse IgG | Invitrogen | A11020 | 1:100 dilution |
| Ig Isotype Control cocktail-C | BD Biosciences | 558659 | Isotype control antibody |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Molecular Probes, Invitrogen | C36950 | Counting beads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Smaller and larger columns are also commercially available |
| MidiMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Falcon 5mL round bottom polypropylene FACS tubes, with Snap Cap, Sterile | In Vitro technologies | 352063 | |
| Glass slides | Menzel-Glaser | J3800AMNZ | |
| Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Inverted microscope | Leica | DMIRB inverted microscope | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
| Cell analyser | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cytospin centrifuge | ThermoScientific | Cytospin 4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Cell analyser software | BD Biosciences | FACS Diva Software | |
| Single cell analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Fluorescent microscope software | Zeiss | Zen 2 blue edition |
References
- Nakeff, A., Maat, B. Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation. Blood. 43 (4), 591-595 (1974).
- Zeigler, F. C., et al. In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells. Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).
- Reems, J. -. A., Pineault, N., Sun, S. In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art. Transfus. Med. Rev. 24 (1), 33-43 (2010).
- Choi, E., Nichol, J. L., Hokom, M. M., Hornkohl, A. C., Hunt, P. Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional. Blood. 85 (2), 402-413 (1995).
- Perdomo, J., et al. A monopartite sequence is essential for p45 NF-E2 nuclear translocation, transcriptional activity and platelet production. J Thromb Haemost. 8 (11), 2542-2553 (2010).
- Shim, M. H., Hoover, A., Blake, N., Drachman, J. G., Reems, J. A. Gene expression profile of primary human CD34+CD38lo cells differentiating along the megakaryocyte lineage. Exp Hematol. 32 (7), 638-648 (2004).
- Feng, Q., et al. Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells. Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).
- Bruno, S., et al. In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution. Haematologica. 88 (4), 379-387 (2003).
- Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro. Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).
- Lev, P. R., et al. Impaired proplatelet formation in immune thrombocytopenia: a novel mechanism contributing to decreased platelet count. Br. J. Haematol. 165 (6), 854-864 (2014).
- Gandhi, M. J., Drachman, J. G., Reems, J. A., Thorning, D., Lannutti, B. J. A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells. Blood Cells Mol. Dis. 35 (1), 70-73 (2005).
- Lu, S. -. J., et al. Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice. Cell Res. 21 (3), 530-545 (2011).
- Moreau, T., et al. Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming. Nature Commun. 7, 11208 (2016).
- De Bruyn, C., Delforge, A., Martiat, P., Bron, D. Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood. Stem Cells Dev. 14 (4), 415-424 (2005).
- Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem cells. 13 (2), 158-166 (1995).
- Italiano, J. E., Patel-Hett, S., Hartwig, J. H. Mechanics of proplatelet elaboration. J Thromb Haemost. 5, 18-23 (2007).
- Matsunaga, T., et al. Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells. Stem cells. 24 (12), 2877-2887 (2006).
- Sullenbarger, B., Bahng, J. H., Gruner, R., Kotov, N., Lasky, L. C. Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds. Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).
- Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand. J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).
- Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation. Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).
- Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. Drug-induced Immune Thrombocytopenia. Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).
- Stasi, R., et al. Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management. Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).
